揭秘PTBP2调控单核细胞抑制神经母细胞瘤进展的分子机制

神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是常见的儿童颅外实体瘤，多起源于肾上腺、腹膜后及后纵膈的交感神经链的神经嵴细胞，占儿童肿瘤相关死亡率的15% [1,2]。其中高危型神经母细胞瘤由于具有高度异质性导致5年生存期不足40%[3]。因此，难治性或复发性神经母细胞瘤患儿需要寻找更有效的治疗方案。免疫治疗给神经母细胞瘤患儿带来福音，然而随着研究的深入发现，神经母细胞瘤免疫原性低、表观遗传缺陷或微环境的改变，导致高危神经母细胞瘤对这些免疫疗法缺乏响应[4,5]。

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中免疫细胞与肿瘤细胞相互作用决定肿瘤的免疫状态，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在肿瘤免疫调节中发挥关键作用。M1型巨噬细胞表达促炎症细胞因子并促进肿瘤免疫应答，而M2型巨噬细胞则表达抗炎性细胞因子和趋化因子，有利于肿瘤免疫逃逸。肿瘤相关单核细胞是肿瘤微环境中TAMs的重要来源，而单核细胞主要来源于骨髓中造血干细胞，可塑性强，在肿瘤微环境中不同因子刺激下可呈现不同表型，进而表现出促进或抑制肿瘤的不同生物学活性。截至目前，单核细胞在神经母细胞瘤微环境中的作用目前研究匮乏。探索神经母细胞瘤与微环境的相互调控可能为难治性神经母细胞瘤的治疗提供新思路和新策略。

该研究基于纵隔神母细胞瘤蛋白组学测序筛选出差异蛋白PTBP2，通过体内外实验阐述PTBP2通过调控单核细胞表型和功能影响神母细胞瘤预后的免疫机制。该研究首次揭示PTBP2对神经母细胞瘤微环境的调控作用，进而为神经母细胞瘤的免疫疗法提供实验依据及理论基础，具有一定的研究意义。

该研究首先针对神经母细胞瘤患儿（NB）术后预后好（1岁以内NB患儿手术未能完整切除，且术后未化疗或拒绝化疗，随访5年未复发、无肿瘤残留，n=5）和预后差（年龄>1岁NB患儿手术未能完整切除，但术后化疗，出现反复复发、甚至死亡，n=5）组织标本进行蛋白组学研究，结果如图1所示：mRNA可变剪切通路富集显著，且可变剪切相关基因在预后差的NB患儿中下调，其中PTBP2变化最明显（图1a-b）。体外实验检测mRNA和蛋白水平表明PTBP2基因和蛋白在预后好NB患儿中高表达（图2中c-f）；公共数据库中对神经母细胞瘤GEO数据集分析，结果显示PTBP2在未复发NB组中表达高于复发组（GSE3446），在GSE4970数据库也发现PTBP2在死亡和进展组中低表达，证实了PTBP2与NB进展负相关，进一步支持PTBP2在NB的发生发展及预后中起到了抑制肿瘤进展的作用。

图1 PTBP2在预后差的NB中高表达

（图源：TangJ, et al., Research, 2023）

作者对GSE3446进行免疫细胞浸润分析，发现单核细胞在预后好的NB组中浸润高于预后差组（图2b），通过对敲降PTBP2后细胞和对照组上清进行细胞因子检测，筛选出分泌差异较大的趋化因子CCL5（图2c）；体外实验发现预后好的NB患儿中CCL5表达高于预后差组（图2e-f）；PTBP2降低或增高可抑制或促进NB细胞CCL5和单核细胞CCR5表达（图2d,i）；功能实验显示过表达PTBP2的NB细胞上清促进体外原代单核细胞及成熟巨噬细胞的迁移（图2g-h），且在加入CCL5中和抗体后PTBP2诱导的趋化及CCR5表达受到抑制（图2j-l）。以上实验表明，NB细胞中PTBP2通过CCL5/CCR5轴诱导单核细胞和巨噬细胞的趋化。

图2 PTBP2通过CCL5诱导单核细胞和巨噬细胞的趋化作用

（图源：TangJ, et al., Research, 2023）

作者在体外构建NB细胞与单核细胞共培养系统，功能学实验显示PTBP2高表达的NB细胞与单核细胞共培养后的上清明显抑制NB细胞的增殖和迁移（图3a-c）。表型实验表明过表达PTBP2组单核细胞中I型干扰素通路通路显著富集，且CD11b+CD80+表型及促炎性因子TNF，NOS2和IL1B基因水平增加（图3d-h）；而PTBP2低表达呈相反趋势；通过分别加入CCL5细胞因子或中和抗体进行干预后发现，无论是CCL5还是中和抗体，都不能改变PTBP2低表达或高表达介导的单核细胞对NB增殖和迁移的影响，以上结果提示PTBP2除了通过增加CCL5诱导单核/巨噬细胞趋化外，还可能通过共同的上游通路激活单核细胞的表型和功能。

图3 PTBP2可能通过诱导单核-巨噬细胞免疫激活表型极化抑制肿瘤细胞生长和迁移

（图源：Tang J, et al., Research, 2023）

作者接下来对PTBP2的调控机制进行探讨，发现PTBP2过表达可直接结合IRF9的外显子6-7-8（E6-7-8）区域，PTBP2敲降可引起IRF9发生可变剪切，将E6-7-8（24164062-24164955）段剪切为E6-8，过表达IRF9（E6-7-8）不仅促进IRF9表达，还增加NB细胞中CCL5及单核细胞炎性表型，表明IRF9（E6-7-8）在IRF9的转录及PTBP2的调控中发挥重要作用。上游机制显示PTBP2高表达可促进STAT1蛋白表达和ISGF3复合物的形成，以及IFNA2和IFNB1表达水平。

体内实验中，作者通过在免疫缺陷NDG小鼠静脉注射过表达或敲低PTBP2的SK-N-SH细胞系来建立转移性NB模型后回输人外周血PBMC，结果表明PTBP2的过表达或敲降明显抑制或促进转移瘤的大小及转移灶数量（图4a-c,e,f）。此外，PTBP2过表达组血液和组织中的人CD11b+CD80+/ CD11b+CD209+的单核细胞/巨噬细胞的比值，CCL5，IFNA2和IFNB1的表达均高于对照组，而在PTBP2敲低后呈现相反趋势（图4d,g-h）。体内实验结果显示PTBP2在通过诱导单核/巨噬细胞的趋化和表型发挥抗肿瘤作用。作者最后分别检测IFNA2和IFNB1在预后好和预后差的神经母细胞瘤患中的表达。与预后差组相比，预后好组的IFNA2和IFNB1水平升高（图4i）。结合体内外结果，作者证实了PTBP2通过抑制IRF9发生可变剪切而失活，促进CCL-5和IFNα/β的分泌发挥下游对单核细胞的调控作用。

图4 PTBP2在体内通过调控单核细胞抑制肿瘤生长

（图源：Tang J, et al., Research, 2023）

图5 PTBP2通过激活IRF9/STAT1/IFN/CCL5调控单核细胞趋化和功能抑制神经母细胞瘤的作用

（图源：Tang J, et al., Research, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究以神经母细胞瘤免疫微环境为研究重点，基于神母细胞瘤的预后差异性从术后不同预后组织标本进行蛋白组学测序并筛选出差异蛋白PTBP2，并进一步通过体内外实验模拟神经母细胞瘤微环境，阐述PTBP2通过促进单核细胞趋化和炎性表型转换发挥的抗肿瘤作用；机制研究表明PTBP2通过抑制IRF9发生可变剪切而失活，促进下游STAT1调控的ISGF复合物形成，最终促进CCL-5和IFNα/β的分泌发挥下游对单核细胞的调控作用。本项目的开展将是首次揭示神经母细胞瘤中PTBP2对单核细胞功能的调控作用及临床意义，为寻找新的神经母细胞瘤分子标记物及治疗靶点提供实验依据及理论基础，有一定的临床转化及应用价值。