肝细胞肝癌(HCC)是全球高发的一种恶性肿瘤，侵袭、转移能力强并且术后复发率高，研究肝癌侵袭和转移的分子机制对肝癌治疗策略的研究具有重要意义。细胞中的某些生物大分子可以通过弱的相互作用相互融合，以相分离（Phase separation）的形式形成有功能的“秩序化”区域（无膜隔室），确保以时空受控的方式发生多种细胞活动，如基因调控，细胞骨架形成等[1-3]。相分离会导致多种疾病的病理性蛋白质聚集，从而促进疾病的进展，其在肝癌中发挥的作用尚未被阐明。最近的研究表明，大多数转录因子（TFs）的激活域具有固有无序区域（IDR），IDR区域复杂度低且含有大量重复的氨基酸序列，在细胞内相变中起着重要作用。TFs、共激活分子等生物大分子通过IDR-IDR的弱相互作用可以形成相分离凝聚物，含有多种转录因子的相分离颗粒可以加速转录调控过程[4-6]。上皮-间充质转化（EMT）是肝癌发生转移和恶性演进的重要机制，转录因子Twist1和YY1是肿瘤中的重要的EMT诱导因子，在多种肿瘤中高表达，并且常伴有临床预后不良。Twist1和YY1的非相分离模式已被广泛报道，但对其相分离调节模式的研究较少。研究表明，miR-9与HCC患者的不良预后相关。然而，miR-9的转录激活调节机制及其在HCC恶性演进中的作用研究较少。

该研究发现Twist1、YY1可以与p300形成转录复合体，在miR-9的超级增强子处形成局部高浓度相分离凝聚物，激活miR-9的表达，进而促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力，促进HCC的恶性演进；并且发现二甲双胍（Met）能够抑制Twist1-YY1-p300相分离颗粒的形成，减少miR-9的表达，从而抑制HCC的恶性演进。该研究为HCC的治疗提供了新的潜在靶点，也为Met抗肿瘤机制的阐释提供了新的思路。

 

 

EMT是肝癌转移的重要机制，转录因子Twist1和YY1是重要的EMT诱导因子，作者首先利用Pull down 实验通过外源导入Flag-Twist1和Flag-YY1表达质粒钓取分别与Twist1，YY1互作的蛋白，通过银染以及Western Blot进一步验证Twist1转录复合体成分（图1A，B）。然后通过Co-IP，GST-Pull down，FPLC等实验进一步确定了肝癌细胞中Twist1-YY1-P300转录复合体的存在（图1C-F）。

 

图1. 肝癌细胞中Twist1与YY1和p300具有相互作用。

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

由于Twist1和YY1的非相分离功能已有很多报道，该研究主要关注了Twist1-YY1-P300转录复合体是否通过相分离形式发挥功能。荧光漂白恢复实验显示，肝癌细胞中Twist1，YY1在核内形成的聚集点具有流动性（图2A-F）。1,6-己二醇是一种相分离的抑制剂，它对Twist1，YY1的相分离聚集点同样具有抑制作用（图2G），表明转录因子Twist1，YY1具有相分离的特征，能够形成相分离凝聚物，而且P300能够促进Twist1和YY1共同聚集在细胞核同一位置。

 

图2. Twist1、YY1能够在细胞核中形成相分离凝聚物，P300能够促进Twist1和YY1相分离凝聚物的形成

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

体外实验研究也表明，Twist1和YY1蛋白的相分离依赖序列中富含极性带电氨基酸的蛋白无序区域（IDR）。该研究纯化了Twist1-IDR和YY1-IDR蛋白，通过体外液滴形成实验发现蛋白的相分离程度与蛋白浓度以及溶剂缓冲液中的盐离子浓度有关（图3A-I）。

 

图3. Twist1和YY1 IDRs的体外相分离研究

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

作者进一步研究了Twist1-YY1-P300相分离复合体的临床意义和其对肝癌细胞功能的影响。通过分析TCGA数据库中肝癌病人的临床数据发现Twist1、YY1在肝癌组织中普遍存在着高表达现象并且影响肝癌患者预后，尤其是Twist1复合体成分都高表达的患者生存期最短，预后最差（图4A，B）。此外，分析复合体中三个蛋白的基因表达量发现Twist1、YY1和P300基因表达量之间呈现正相关（图4C）。随后，利用划痕、侵袭、明胶足迹实验进一步验证了Twist1-YY1-P300复合体具有促进肝癌细胞迁移与侵袭的作用（图4D-F）。

 

图4. Twist1相分离复合体能够促进HCC的恶性演进

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

作者进一步研究了Twist1相分离复合体促进HCC演进的分子机制。由于已经有大量研究报道了Twist1对蛋白靶基因的转录激活，而miRNAs在肝癌恶性演进中也具有重要的作用，因此本研究主要关注了Twist1复合体对miRNAs的调节。作者首先利用全转录组测序结果对Twist1，YY1下游调控基因及肝癌组织中高表达的基因进行Venn分析，筛选出4个表达量明显升高的miRNA，随后，通过生存期分析筛选出Twist1，YY1共同调控的对肝癌预后有显著影响的miR-9（图5A-E）。随后利用过表达/干扰实验和miR-9抑制剂/模拟物验证了Twist1-YY1-P300复合体的功能与miR-9的关系。结果表明，Twist1-YY1-P300复合体主要通过miR-9发挥促进肝癌细胞迁移侵袭和EMT的作用（图5F-I）。

 

图5. Twist1相分离复合体通过调节miR-9的表达促进肝癌细胞的EMT

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

进一步作者探索Twist1复合体如何调节miR-9的表达。ChIP-seq结果显示，Twist1相分离复合体能够结合到miR-9上游的超级增强子（Super Enhancer，SE）区域，并且发现SE区域位于Chr1:156 443 704-156 510 361（-）（图6A，B）。原位荧光杂交实验结果也显示，Twist1，YY1能够与super enhancer DNA探针以及Nascent RNA探针在细胞核中共定位，证明Twist1，YY1结合在miR-9的超级增强子位置；应用突变型Twist1（D/E或R/K突变为A）和YY1（D/A突变）进一步证明了Twist1/YY1以相分离的形式结合在miR-9 SE区域；相分离抑制剂1,6-己二醇也可以抑制miR-9的表达（图6C-E）。利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-9的超级增强子进一步验证了miR-9的super enhancer在 Twist1相分离复合体促进肝癌演进中发挥着重要作用（图6F-K）。

 

图6. Twist1相分离复合体结合在miR-9的super enhancer处，激活miR-9的表达促进肝癌恶性演进

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

基于Twist1-YY1-p300相分离凝聚物在肝癌演进中的作用，作者进一步筛选了能够抑制相分离复合体形成的药物。由于Twist1与YY1形成相分离主要依赖于其柔性区的极性氨基酸残基，当这些残基突变后则失去相分离能力，进而削弱了促进肝癌演进的能力。通过分析复合体中极性氨基酸残基的电荷分布特性和疏水口袋，从化合物库中筛选了具有极性结构域和疏水尾端的小分子，进一步通过相分离体外组装、细胞内相分离扰动等方法进行活性筛选，最终发现小分子二甲双胍具有较高活性。二甲双胍可以在体外直接抑制Twist1、YY1形成相分离复合体，同时也在细胞内扰动相分离复合体的组装，并且呈剂量依赖性（图7A-D）。靶基因和功能分析也表明，二甲双胍抑制了由该相分离复合体带来的靶基因表达，同时表现出抗肿瘤活性（图7E-K）。该工作对二甲双胍药理活性的研究提供了新的思路。

 

图7. 二甲双胍可以通过干扰肿瘤生长依赖的Twist1-YY1-p300转录复合体的相分离状态发挥抑制肝癌恶性演进的作用

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

图8. 机制图

（图源：Meng J, et al., Pharmacological Research, 2023）

 

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究通过生化水平的研究发现Twist1-YY1-P300共同构成一个转录复合体，并且这个复合体呈现为相分离凝聚物形态，本研究对转录因子Twist1 和YY1以相分离模式发挥共转录作用进行了深入研究。该研究选择miRNAs作为研究重点，发现Twist1-YY1-P300相分离形式的复合体，而非普通转录复合体，通过结合miRNA-9的super enhancer促进miR-9的表达，进而促进HCC的恶性演进，并且鉴定了该相分离复合体结合miR-9 super enhancer的序列。药物筛选结果表明，二甲双胍可以抑制Twist1-YY1-P300相分离复合体的相分离稳定性以及其对靶基因的结合与调节，从而抑制HCC的恶性演进。该研究表明Twist1-YY1-P300相分离复合体可能为HCC治疗的潜在靶点；二甲双胍作为相分离复合体的抑制剂为其抗肿瘤机制的阐释提供了新的思路。