除了常规的酶切连接外，你还了解其他的分子克隆技术吗？

酶切连接法

酶切连接法属于经典的分子克隆方法，利用限制性内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA，最后转化筛选及纯化，完成重组基因的大量制备。

图1 酶切连接流程

成功的酶切和有效的连接是分子克隆实验圆满完成的必要条件。限制性内切酶能特异性地结合于能被限制性内切酶识别的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。根据限制酶的识别切割特性、催化条件以及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。分子克隆技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。

粘性末端，即限制性内切酶在DNA双链上交错切割，形成的核苷酸顺序互补的，可形成氢键的末端（见图2）。

平齐末端，限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断（见图3）。

图2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

图3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

限制性内切酶产品特点

✦快速酶切：5-15min即可完成酶切；
✦通用的buffer：大大简化了酶切反应；
✦高保真：极低的星号活性；
✦高度冗余：轻松应对过量、复杂底物；
✦完美兼容：经验证所有Absin快速内切酶与其他品牌酶切体系相互兼容。

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA接酶催化双链DNA子中相邻碱基的5’-P末端与3-0H间形成3’,5’-磷酸二酯键。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶——T4 DNA Ligase被称为生物界的“502”。在有Mg2+和ATP存在的条件下，T4 DNA Ligase能催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化双链DNA的平末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切刻，但不能催化单链DNA之间的连接。

图4 T4 DNA连接酶作用位点

TA克隆

TA克隆是指把PCR片段与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。可用于不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法重组到T-载体中，通过测序测定DNA序列。Absin T-Vector快速克隆试剂盒是高效、便利的PCR产物克隆专用试剂盒。

T-Vector快速克隆试剂盒产品特点

✦阳性率高：高纯度酶切型线性T载体，连接效率更高，蓝斑率低于10% ；
✦方便快捷：预混连接反应体系，最快5分钟实现连接，无需纯化，直接转化；
✦T Simple载体无常用酶切位点，利于含酶切位点基因克隆；
✦无NdeI或NcoI位点，便于重组表达基因的克隆；
✦提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照；
✦蓝白筛选：高表达活性的β-半乳糖苷酶，显色更快更深；
✦批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测。

图5 TA克隆流程

无缝克隆

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。Absin快速多片段DNA组装预混液就是基于重组原理的无缝克隆技术，它不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

快速多片段DNA组装预混液特点

✦简单便捷：兼容PCR产物体系与载体酶切体系，省去繁琐的纯化步骤；

✦高阳性率：定向克隆单个DNA片段至载体上，阳性率高于95%；

✦快速反应：反应时间大大缩短，最快仅需5min；

✦单/多片段均可连接：单个或多个片段同时插入，省去重复纯化与酶切过程。

图6 Absin快速多片段DNA组装预混液无缝克隆操作流程

TOPO克隆

TOPO克隆实际是基于拓扑异构酶的克隆技术，关键是拓扑异构酶。该技术不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。

TOPO克隆产品特点

✦快捷，不需连接酶，克隆三步到位。

Geteway克隆

Geteway克隆利用位点特异重组实现目的片段的插入的，载体上的一段目的片段在重组酶的作用下会替换成目的片段，不依赖限制性内切酶和连接酶，导入目的基因不需要开环处理，载体需要用试剂盒提供的载体，一般需要用到两个载体，快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆。