发现软骨耐受缺氧的新机制-血红蛋白小体维持供氧稳态

O2作为最重要的反应底物参与细胞的多种生化反应和能量代谢，对于细胞的存活和生命活动至关重要[1-3]。哺乳动物包括人类主要通过红细胞中的血红蛋白这一运氧载体经由循环系统向全身组织细胞供给氧气。但是，软骨组织是独特的无血管组织，软骨细胞所需的氧气主要通过从周围组织扩散[4]。软骨发育导致的体积增大和运动产生的机械应力往往会导致软骨组织的缺氧程度加剧和耗氧量增加[5-7]。已知软骨细胞在氧气缺乏的情况下，可以通过HIF分子抑制线粒体的氧化磷酸化反应，从而减少氧气消耗[8, 9]。然而，软骨细胞是通过何种机制维持氧气供应的稳态，至今仍不清楚。

首次报道了乏氧促进软骨细胞产生大量的血红蛋白，血红蛋白通过液液相分离（liquid-liquid phase separation，LLPS）的方式聚集，在细胞质内形成无膜的血红蛋白小体（Hemoglobin Body，Hedy），并以此为氧气储存结构，在组织缺氧加剧或者细胞耗氧增加的时候，释放其中储存的氧气，以维持软骨细胞的存活和软骨发育。

在本研究中，研究者在人和小鼠的软骨组织中均发现了被伊红深着色的小体样结构，通过免疫组化、显微切割结合质谱分析等多种手段进一步发现这种小体结构的主要成分为成体血红蛋白，故而研究者将其命名为血红蛋白小体（Hedy）。

图1. 软细胞中深着色的小体样结构（a, b），经显微切割获取小体结构经由质谱分析显示成分主要为血红蛋白（c, d）

对Hedy进行电镜观察后，发现其为软骨细胞胞质内形状规则的无膜结构。进一步，通过荧光显微成像技术发现，过表达的血红蛋白可以在细胞内自行聚合形成蛋白小体，且具有液液相分离的特征。进一步通过突变其内在无序区域，可以显著抑制其聚合能力。而且体外液液相分离实验也同样证实了血红蛋白的液液相分离能力。综上，证明了血红蛋白可能通过液液相分离机制形成Hedy。

图2. 血红蛋白亚基（β）在细胞内可以形成聚集体（a, b），聚集体之间可以相互融合（c），而且具有光漂白后恢复的特性（d, e）。光电关联技术证实其聚集体为规则的无膜结构

研究者通过乏氧处理软骨组织和软骨细胞发现，乏氧可以显著诱导软骨细胞的血红蛋白表达，但乏氧对于血红蛋白的调控并不依赖传统的HIF1/2，而是通过KDM5A直接上调KLF1进而促进血红蛋白的产生。至此，研究者发现了软骨细胞中区别于红细胞的一种新的血红蛋白表达调节机制。

进一步，通过建立软骨组织特异性血红蛋白敲除的动物模型，研究人员发现血红蛋白会敲除导致Hedy结构受损，同时加剧了软骨组织的缺氧程度，造成了软骨细胞的大量死亡。通过测定软骨细胞的氧离曲线发现，含有Hedy的软骨细胞的氧离曲线相对于血红细胞显著左偏（P50 = 27.85 mmHg from 58.2 mmHg），氧结合力显著增强，并且在低氧条件下能够释放氧气，从而缓解细胞缺氧促进软骨细胞的存活。

图3. 敲除血红蛋白明显造成了软骨组织的生长板区域的细胞大量死亡（a, b），同时造成了血红蛋白小体结构的破坏（c）以及软骨缺氧程度的加剧（d）

文章结论与讨论，启发与展望

本研究阐明了软骨细胞维持细胞内氧稳态，适应缺氧环境的新机制，首次揭示了红细胞外血红蛋白在正常组织中发挥的重要生物学功能，而且发现了血红蛋白表达调控的新机制。与这些发现一致的是，地中海贫血综合征患者通常患有关节疼痛[10]，贫血在患有软骨相关疾病的患者中也很常见，如类风湿性关节炎（RA，约30%至70%）[11,12]和软骨发育不全（约73%）[13]。此外，血红蛋白较低的RA患者表现出更严重的关节疾病[14]，治疗贫血能显著缓解关节症状[15]。这提示软骨细胞中的血红蛋白可能在疾病过程中发挥着重要作用。另外，研究者发现了血红蛋白的液液相分离特性，首次发现了通过液液相分离机制血红蛋白可以形成具有生物学功能新的细胞结构-Hedy。当然血红蛋白在软骨中的亚基结合方式以及其他辅因子是否参与结构构成在此项研究中并未深入探讨，而且软骨细胞中的血红蛋白为何具有更强的氧气结合力，这与Hedy的形成是否有关？接受何种机制调节？这些问题仍有待进一步研究。