合作研发基于高保真DNA聚合酶和DNA模板的精准基因编辑工具

先导编辑（Prime editing）通过将编辑向导RNA (pegRNA)和逆转录酶 (RT) 添加到 CRISPR 相关基因组编辑系统中，实现精准基因编辑[1]。然而，pegRNA 的复杂性可能会阻碍编辑能力。pegRNA包含单个引导 RNA (sgRNA)，逆转录模板 (RTT) 和引物 3' 端的结合序列 (PBS)。对于点突变或者小插入，pegRNA长度通常约为 125–130 个核苷酸；对于更大的插入，则需要更长的pegRNA。体外生产这种长单链 pegRNA 价格昂贵、耗时、且难达到高产率和高纯度。此外，与 sgRNA（通过与 Cas9 蛋白紧密结合而受保护）相比，核酸酶敏感的pegRNA 的 3'延伸（RTT+PBS）很容易在细胞中降解，尽管目前已有相关策略尝试解决这一问题。除此之外，PBS 不可避免地与 pegRNA 的间隔区（spacer）互补，这可能会导致分子内错误折叠并减弱效应蛋白的加载和降低编辑效率[2]。

与许多其他DNA 聚合酶不同，RT 酶缺乏校对活性，因此保真性低易出错，错误率约为1/2000（MMLV-RT，1/~11,000 nt)。但是随着插入片段的延长，或编辑细胞的数量变大（例如，在整个器官中），错误的频率可能会增加。此外，RT 对于脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）底物的亲和力较低（如MMLV RT约为 10–100μM），这可能抑制了RT的酶活。然而细胞内 dNTP 浓度在非S 期（例如，体内的大多数细胞处于非S期中）时显著降低，将进一步限制RT的活性。最后， RT 持续合成能力（Processivity）通常较低，这可能是造成大片段插入困难的原因之一。相对于RT酶而言，一些 DNA 依赖性 DNA 聚合酶具有极高的准确性和持续合成能力，并且具有更强 dNTP 亲和力（例如phi29 DNA 聚合酶约为 1 × 102–4 × 102 nM）。然而到目前为止，尚未有DNA 依赖性 DNA 聚合酶协同切口酶 Cas9(nCas9)和外源模板用于哺乳动物细胞精确基因组编辑的相关报道[3]。

课题组之前开发了可拆分的先导编辑 (sPE)，包括将PE2融合蛋白拆分为nCas9和RT，以及将pegRNA拆分为sgRNA和 RTT-PBS序列[2]。其中PBS/RTT通过 MS2 aptamer 连接到 MCP-RT上。此外，PBS/RTT 可以环化(petRNA) ，使其稳定，防止核酸外切酶降解。因此在细胞内环化的petRNA比线性的petRNA编辑效率大幅度提高。然而，生化实验已经证实MMLV RT 除了具有典型的 RNA 模板 DNA 合成活性外，还可接受 DNA 作为模板。因此作者假设将线性引物编辑模板（LPET）内部的RNA成分替换成DNA以及在末端进行更广泛的修饰以防止核酸外切酶消化，进而可能增强模板稳定性和提高基因编辑效率。

为了验证这一假设，作者首先合成了含有DNA（替换全部RTT区域，LPET+0）的并且5’端带有MS2序列（以结合MCP-RT）的LPET，并且LPET 末端具有三个 2'-O-甲基/硫代磷酸酯键用来抵抗核酸外切酶降解。作者采用了全mRNA/sgRNA（不包含任何质粒成分）电转体系（包括nCas9 mRNA, MCP-RT mRNA, sgRNA 和nicking sgRNA）(图1a, b)。作者发现含有DNA成分的LPET可以介导高效的(10% to 50%)具有剂量依赖性的精确先导编辑（图1b-d）。在此基础上，进行了一系列的不同程度的DNA取代，发现含有DNA的LPET（如LPET+2）基因编辑效率显著高于全RNA的线性LPET(-17) (图1d)。但是随着DNA取代延申至整个PBS区域(例如LPET+8-+11)，编辑活性随之减弱。以上实验结果表明包含DNA成分的LPET可以进行高效率的先导编辑(图1d)。

基于包含DNA成分的LPET介导的高效先导编辑结果，作者进一步假设DNA依赖的DNA聚合酶可能取代逆转录酶进行基因编辑。为了验证这个假设，作者选择了具有极高保真性, 极强的DNA合成能力和dNTP亲和力的DNA聚合酶Phi29。使用相同的一组DPETs (DNA Polymerase Editing Templates), 研究人员发现Phi29可以介导高达50%的基因编辑（图2a-b）。由于MS2-MCP偶联成分中MS2适体序列是RNA，导致整个LPET/DPET仍然具有RNA成分，使得合成相对困难，尽管相对于纯RNA的LPET已经大幅降低了合成成本和难度。为了进一步解决这个问题，作者使用生物素和链霉亲和素偶联系统（Biotin and Streptavidin）来代替MS2-MCP（图2c）。数据表明，尽管生物素和链霉亲和素偶联系统可以支持先导编辑，其效率较MS2-MCP偏低，提示基于生物素和链霉亲和素偶联系统的编辑体系仍然需要优化（图2d-e）。另外作者还尝试了其他多种多样的化学修饰，包括2'-O-甲基、硫代磷酸酯、2'-氟或者他们的组合修饰，这些化学修饰被证明都可以被应用到LPET和DPET上。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究首次运用高保真Phi29 DNA聚合酶和DNA模板进行精确基因编辑。相对于逆转录酶，高保真DNA聚合酶能够极大降低了先导编辑潜在引入错误的可能性。同时使用含有DNA模板稳定且易合成，降低了成本，解决了传统的pegRNA化学合成困难的问题，进一步拓展了模块化先导编辑工具箱，为先导编辑非病毒载体的体内递送和临床应用开辟了新的方向。