IRF4: NK细胞抗病毒适应性免疫的信号整合器

自然杀伤细胞（nature killer, NK）是一种具有细胞毒性的先天性淋巴细胞，可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中发挥重要作用。NK细胞是参与固有免疫的重要成员，但是最近的研究发现，NK细胞也能展示适应性免疫细胞的一些特征，如抗原特异性，克隆扩增和产生免疫记忆[1]。与T细胞类似，NK细胞抗病毒感染的先天和适应性免疫反应过程需要抗原、共刺激因子、促炎细胞因子等信号协同作用，然而，如何整合这些信号来驱动NK细胞的适应性免疫反应尚待阐明。干扰素调节因子（interferon regulatory factor, IRF）是一类调节干扰素应答的转录因子，包括IRF1-IRF9，在病毒、细菌和干扰素诱导的信号通路以及先天和适应性免疫过程的调节中发挥重要作用[2]。其中，IRF4在B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等淋巴样细胞中特异性表达，在免疫细胞的发育、分化和细胞命运决定中具有关键作用[3]，但是其在NK细胞中的作用并不清楚。

IRF家族成员IRF8和IRF9在NK细胞中的功能此前已有报道，这里作者探究IRF4在NK细胞中的表达情况。借助MCMV感染模型，作者发现病毒感染后小鼠Ly49H⁺NK细胞IRF4表达上调，且在感染后2-3天转录和蛋白水平分别达到峰值，同时ATAC-seq分析染色质开放区域动态变化显示IRF4、AP-1、IRF: bZIP结构域在感染后第4天富集，提示IRF4与AP-1等转录调节因子存在相互作用。作者也分析了感染HCMV的人NKG2C⁺ NK细胞，ATAC-seq发现适应性NK细胞与其它不成熟的NK细胞亚群的表观遗传学特征截然不同，与该适应性NKG2C⁺NK细胞亚群中IRF4启动子的高可及性相关。另一项RNA-seq分析也显示适应性NKG2C⁺NK细胞亚群IRF4相较其他不成熟NK细胞亚群高表达（图1）。在人和小鼠中，IRF4在NK细胞中的最佳表达需要促炎细胞因子、激活受体等多种协调信号共同作用。因此，IRF4可以作为一个保守的“枢纽”，在跨物种的抗病毒NK细胞反应过程中整合多种信号。

图1 NK细胞上调IRF4以应对病毒感染

接着作者探究IRF4在NK细胞发育过程中的作用。流式细胞术检测IRF4敲除小鼠(Irf4^-/-)与同窝野生型对照小鼠（WT）以及WT (CD45.1):Irf^-/-(CD45.2)嵌合体小鼠Ly49H⁺ NK细胞表型，发现稳态NK细胞数量和成熟度不受IRF4缺失影响。为进一步明确IRF4在NK细胞的内源性功能，研究者将相同数量的WT和Irf^-/- Ly49H⁺ NK细胞移植入Rag2^−/−Il2rg^−/−小鼠，感染MCMV后接受Irf^-/- Ly49H⁺ NK细胞移植的小鼠很快死于病毒感染，提示NK细胞内源性IRF4表达对宿主抵御MCMV感染至关重要。进一步研究发现MCMV感染后Irf^-/^-NK细胞增殖受阻。利用CellTrace Violet标记细胞显示WT和Irf^-/- Ly49H⁺ NK细胞分裂能力相当，但是活化的Irf^-^/- Ly49H⁺ NK细胞不能下调促凋亡分子BIM，对BCL2抑制剂处理后的细胞死亡更敏感（图2）。这些结果表明病毒感染期间IRF4通过调节BIM的表达调控NK细胞存活。

图2 IRF4通过调节BIM的表达调控NK细胞存活

作者继续探究IRF4是否促进效应NK细胞分化。感染MCMV后第7天分离WT和Irf^-/- Ly49H⁺ NK细胞，流式分析发现Irf^-/- Ly49H⁺ NK细胞成熟（CD27^-CD62L^-）比例降低。细胞成熟标志物Ly6C、CX₃CR1、KLRG在Irf^-^/- NK细胞中表达较WT NK细胞也相应降低。这些结果表明，IRF4在病毒感染期间调控NK细胞分化，并有助于NK细胞适应性反应的异质性。为更好呈现IRF4的动态作用，作者对WT：Irf^-/- mBMC小鼠感染MCMV后0, 2, 4, 5, 7天的Ly49H⁺ NK细胞检测发现与WT NK细胞相比，Irf^-/-Ly49H⁺ NK细胞在第4天开始降低，与此同时，成熟的NK细胞（CD27^-CD62L^-）比例降低（图3）。提示IRF4在病毒感染早期调控转录程序影响NK细胞存活和分化。

图3 IRF4促进效应NK细胞分化

接着作者分选WT：Irf^-/- mBMC小鼠感染MCMV后0, 2, 4, 7天脾脏中Ly49H⁺NK细胞进行单细胞测序，结果显示第7天的WT和Irf^-/-Ly49H⁺NK细胞转录图谱存在很大差异，Irf^-/- Ly49H⁺NK细胞下调的基因多集中在NK细胞分化、效应CD8⁺T细胞功能、淋巴细胞成熟等通路。这些结果提示IRF4驱动转录程序，在病毒感染期间调节NK细胞存活和分化。

GSEA分析显示第7天WT和Irf^-/- Ly49H⁺NK细胞差异基因富集通路集中在代谢相关通路和MYC targets通路。MYC蛋白在感染早期表达量上升，但是在WT和Irf^-/-NK细胞间无差异，但是MYC的靶基因CD98和CD71在病毒感染后的Irf^-/-NK细胞中显著下调。已知CD98编码Slc3a2，调节大的中性氨基酸摄入。CD71也称作转铁蛋白（Tfrc），在铁摄取中起重要作用。Irf^{-/ -}NK细胞摄取L-中性氨基酸能力降低，感染MCMV期间转铁蛋白表达受损，提示IRF4控制NK细胞摄取营养物质的能力，这些营养物质的摄取可能是NK细胞抗病毒反应所必需的。使用BCH抑制LAT1-CD98不影响感染病毒后NK细胞扩增和分化，而使用铁螯合剂deferiprone抑制NK细胞铁储积，感染MCMV小鼠血液、肝脏、肾脏NK细胞数量和比例均显著降低。Deferiprone处理后的NK细胞特征与Irf4^-/-NK细胞表型相似，表现为成熟细胞比例下降，细胞成熟标志基因 CX₃CR1和KLRG1表达降低，BIM维持高表达（图4）。因此，作者猜想在Irf4^-/-NK细胞观察到的铁摄取中断导致了抗病毒NK细胞适应性免疫反应缺陷。

图4 IRF4调节NK细胞适应性免疫期间营养摄取

为进一步深入验证IRF4对NK细胞的直接转录调控，作者对未接受刺激和NK1.1+促炎细胞因子刺激的NK细胞进行ChIP-seq，共鉴定了12344个IRF4结合峰。与未刺激的对照相比，大多数峰（n=10795 peaks）是在刺激条件下特异性检测到的。值得注意的是，作者观察到IRF4可与Bcl2l11和Sell基因座直接结合，分别表明其对细胞存活和分化的直接调节。此外，作者还观察到IRF4与Tfrc和Ireb2基因座强结合，这两个基因与铁摄取相关（图5）。这些结果突出了IRF4直接参与调节NK细胞的存活、分化和适应性免疫反应期的营养摄取。

图5 IRF4直接调控适应性NK细胞特征

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究基于小鼠模型，结合ATAC-seq、scRNA-seq、和ChIP-seq证明转录因子IRF4驱动早期转录程序，直接调节铁摄取、细胞存活等信号通路，参与调节NK细胞的存活、分化和营养摄取，促进MCMV感染期间NK细胞的效应分化和适应性免疫反应。值得注意的是，IRF4驱动的NK细胞的调控作用是抗病毒感染过程特有的，稳态条件下NK细胞成熟和增殖不受IRF4影响。该研究结果提出了IRF4整合信号以促进NK细胞抗病毒效应和记忆分化中的功能，与其促进效应CD8⁺T细胞分化功能相似，提示细胞毒性淋巴细胞对病毒感染反应的共同潜在机制。基于IRF4改造NK细胞可为抗病毒感染和抗肿瘤免疫提供新的思路。

该研究也存在一些不足之处，文中揭示的IRF4的转录调控是笼统的，IRF4介导的转录如何实现下游的具体功能需要进一步解析。IRF家族不同成员似乎以不同的信号途径实现对细胞抗病毒免疫的调控，如何解析和整合这些信号途径也是一个值得探索的方向。