发现细胞表面硫酸乙酰肝素促进刺突蛋白介导细胞融合的机理

SARS-CoV-2 感染会引发受感染细胞与邻近ACE2 阳性细胞发生刺突蛋白依赖性的细胞融合，产生多核合胞体。实现这一过程需要的细胞表面刺突蛋白可以通过两个不同渠道获得：1 ) 病毒膜与胞膜的融合和 2) 病毒进入细胞后新刺突蛋白的合成。值得一提的是，当病毒与质膜融合时，病毒和细胞的体积差异会极大限制胞膜上刺突浓度。另一方面，由于刺突蛋白含有一个内质网(ER)滞留信号，大部分新合成的刺突会被滞留在内质网。这些原因综合起来会限制受感染细胞表面刺突蛋白的浓度。尽管如此，在因新冠（COVID-19）去世的患者肺部常常能观察到细胞融合造成的大合胞体。研究提示刺突蛋白诱导的细胞融合可能是导致重症新冠相关的炎症、血栓、或淋巴细胞减少的一个因素。另有证据表明大合胞体的形成可以促进 SARS-CoV-2 传播并且帮助病毒逃避抗体中和。值得注意的是，不同的SARS-CoV-2 变体所携带的刺突蛋白具有不同的细胞融合诱导能力。而这其中又属Delta株具有最高的膜融合诱导活性。巧合的是， Delta 变体的出现在时间上与世界范围重症新冠住院率的增加几乎完全重叠。这些都提示感染引发细胞融合的严重度或许是造成SARS-CoV-2 重症感染的一大指征。因此阐明刺突蛋白如何在受感染的细胞表面维持高融合活性或许能有助于寻找治疗重症新冠的方法。

细胞表面硫酸乙酰肝素 (HS)带有大量负电荷，能有效吸附许多胞外大分子甚至病毒，帮助它们进入内吞体，从而进入细胞。叶一泓团队和加州大学圣迭哥分校Jeff Esko团队此前同时发现HS可以作为SARS-CoV-2的辅助受体，帮助SARS-CoV-2病毒感染细胞。在这基础上，叶一泓和陈丽强团队找到两个能和HS有效结合的药物-米托蒽醌 (Mitoxantron) 和吡蒽醌（Pixantrone）, 均可在体外有效抑制胞吞介导的SARS-CoV-2细胞感染。

团队分别用生物化学和核磁共振的手段研究了这两个药物与HS的结合机理，发现它们都用一个二羟基蒽醌核心基团去选择性的结合HS上的硫基团，但这两个药物选择的硫基团不同。米托蒽醌和吡蒽醌最早发现是DNA拓扑聚合酶的抑制剂。米托蒽醌已经在临床上用于治疗一些特定的肿瘤。与米托蒽醌相比，吡蒽醌抗肿瘤的活性还在临床测试中。叶一泓团队发现吡蒽醌与HS的结合力几乎与米托蒽醌一致，但细胞安全性有显著改善。谢航团队发现实验小鼠对吡蒽醌也表现出很好的耐受性。在小鼠实验中，吡蒽醌也显现出一定的抗病毒能力。由此可见，米托蒽醌和吡蒽醌有可能被重新利用于抗病毒的治疗中。

随着疫情发展，叶一泓和谢航团队测试了这两个药物对随后出现的变种，尤其是致病力更强的Delta SARS-CoV-2变种是否有抑制作用。令人遗憾的是，这两个药对这一新变种的体外抑制作用相较于原始病毒要弱很多。这或许是因为这个新变种不需要经过细胞内吞，而主要通过与细胞质膜的直接融合来感染细胞的。但有趣的是，与其它变种相比，Delta SARS-CoV-2变种具有超强的细胞融合刺激作用。在一些体外感染的细胞里，可以出现多达60-80个细胞核的多核合胞体。但在米托蒽醌或是吡蒽醌处理过的感染细胞里，多核合胞体大都只含有三到四个核。这表明HS有可能参与细胞融合的调控，而这一作用会被米托蒽醌或是吡蒽醌抑制。

为验证这一猜想，叶一泓团队构建了一个SLC35B2 敲除但表达ACE2-GFP的细胞系。因为硫转运通路的缺失，这个细胞系表面不含有HS。结果证明，剌突蛋白引发的细胞融合，在HS缺失的条件下明显受到抑制，多核合胞体中核的数量与药物处理过的细胞类似。由此可见， HS是刺突蛋白诱发细胞融合的关键宿主因子。

图1 刺突诱导的细胞-细胞融合的4D共聚焦成像

为研究HS参与细胞融合的机理，叶一泓团队建立了一个体外细胞融合的实验体系，并用此进一步分析了HS参与细胞融合的关键步骤。通过萤光呈像对活细胞融合的观测，他们发现正常情况下，当ACE2-GFP阳性细胞接触刺突蛋白阳性细胞时，ACE- GFP2会在两个细胞的接触点形成超聚体(图1)。与此同时，刺突蛋白会聚集于相对应的细胞表面。由于ACE2和刺突蛋白的紧密结合力，两个细胞间会形成类似于免疫轴突似的细胞紧密结合。通过透射电镜，他们在这一区域可以经常观察到类似融合孔的结构。而在HS缺失或被抑制的情况下，ACE2不能有效形成超聚体。所以当ACE2阳性细胞遇到刺突阳性的细胞时，两个细胞不能形成细胞间的紧密突触连接 (图2)。这也解释了为什么刺突蛋白在这一情况下即使可以被细胞表面蛋白酶激活，却也不能有效催生细胞间的融合孔。

图2 PIXN破坏刺突细胞和ACE2-GFP细胞之间的突触样细胞-细胞接触

团队进一步发现ACE2超聚体的形成需要ACE2上一段介于受体的胞外区域和夸膜域之间的保守序列。虽然这一序列只形成一段松散的无固定结构的连接域，而且此前研究也没有发现任何重要功能，叶一泓团队发现缺失这一序列的ACE2无法形成超聚体，因而即使在细胞中表达定位都和野生型ACE2一致，细胞也无法有效地和刺突蛋白表达的细胞进行融合。

图3 HS促进刺突诱导的ACE2在无细胞系统中聚集。

为了证明HS可以直接参与ACE2超聚体的形成。叶一泓团队利用纯化的蛋白在荧光共聚焦显微镜下重组了ACE2超聚体的形成。他们发现，当荧光标记的ACE2被偶联到重组的脂膜上，只有当刺突蛋白和HS同时存在的条件下，才能有效形成超聚体（图3）。在仅有刺突蛋白的条件下，ACE2超聚体的形成要缓慢的朵。这一现象表明在刺突蛋白存在的条件下，HS可以直接影响ACE2受体和刺突蛋白的相互作用，从而促进ACE2超聚体的形成。

图4 HS辅助的ACE2聚集有助于克服融合诱导的刺突稀释，在融合位点保持高水平的融合原

文章结论与讨论，启发与展望

团队及其合作者的研究表明HS 可以直接参与刺突蛋白和 ACE2 的结合反应，协助诱导ACE2发生构象变化，从而允许保守的连接区域引发ACE2 的聚集。由于聚集的 ACE2 可以与相对膜上的刺突结合，这些多价蛋白相互作用也因此聚集了刺突，同时将两个细胞膜偶联在一起形成突触样结构，进而促进膜融合。虽然关于HS 是如何促进 ACE2 超聚体的机理仍有待阐明，该团队的发现可以很好的解释刺突蛋白如何在低表面浓度下仍可以有效促进细胞融合（图 4）。

该研究还首次探寻了利用和HS有亲合力的药物来抑制SARS-CoV-2 感染的可能性。由于细胞表面硫酸乙酰肝素(HS) 可以作为协助SARS-CoV-2和其他病毒入侵的关键辅助受体，HS结合药物或许可以用来抑制内吞作用介导的病毒感染。这一假说已经在大量体外实验中被证实。而新研究首次证明HS抑制剂吡蒽醌在小鼠模型中也有一定的抗病毒效用。另外，鉴于HS在病毒感染引发细胞融合中也有重要作用， HS 抑制剂有望能同时抑制SARS-CoV-2 病毒感染和刺突蛋白引发的细胞融合。叶一泓团队的研究拓广了HS在病毒感染，特别是重症新冠发病机理中的作用。细胞表面硫酸乙酰肝素在未来有可能成为治疗重症新冠和其他病毒感染的新靶点。