绘制骨腱界面发育细胞图谱

骨腱界面（bone-tendon interface）也称为腱止结构（enthesis），由骨、钙化的纤维软骨、未钙化的纤维软骨、肌腱四层连续渐变的组织构成，它能有效地传递并分散应力，使肌肉和骨骼之间力学载荷高效传递，对骨骼肌肉的功能和关节运动至关重要。研究表明，骨腱界面中梯度分布的纤维软骨细胞及其分泌的细胞外基质是参与应力分散的主要成分，纤维软骨的发育模式类似于生长板中软骨细胞的分化：原始软骨细胞通过肥大化，形成成体骨腱界面中的未钙化纤维软骨和钙化纤维软骨。然而，目前对骨腱界面纤维软骨的发育细胞来源及其调控机制尚不充分。

该课题组成员利用基因组转录数据的无偏聚类方法，识别了出生后骨腱界面处发育中存在的不同细胞群体。通过将他们的数据与开源数据集整合，文章作者获得了来自超过8,000个细胞的高质量转录数据，揭示了包括软骨细胞、肌腱细胞、骨细胞、骨腱界面前体细胞和间充质前体细胞等各种细胞群。通过空间转录组数据和免疫荧光进一步验证了相关细胞标记物的存在，揭示了它们在出生后发育过程中的动态变化。

图1. 单细胞测序联合空间转录组测序绘制骨腱界面纤维软骨发育主要细胞类型。

接着，课题组探索了骨腱界面细胞的发育轨迹以及调控其发育的基因，发现在出生后的交界区细胞中，骨腱界面前体细胞具有一定的干细胞特性，并揭示了它们分化为纤维软骨细胞的轨迹和细胞命运。同时，研究进行了骨腱界面软骨细胞分化过程的轨迹重建和基因动态分析。研究着重关注了干祖细胞分化为纤维软骨细胞的关键步骤，并揭示了其基因动态特征。分析表明，随着时间的推移，骨腱界面软骨细胞分化过程中涉及到的生物学过程，如细胞外基质组织、胶原纤维组织和对生长因子刺激的细胞反应的调节逐渐上调。此外，该研究还鉴定了在骨腱界面软骨细胞分化过程中表达显著的基因模块，其中一些与软骨发育、骨化和生物矿化有关。确认了在这个过程中具有重要驱动作用的一些基因，如Klf9、Klf4、Clec3a、Mfge8和Tnn的表达，并验证了Mfge8和Tnn蛋白在骨腱界面中的分布（图2a-j）。

图2. 鉴定发现骨腱界面纤维软骨细胞分化的重要驱动基因。

最后，作者通过比较主要细胞群集的GO功能注释，确定了骨腱界面纤维软骨细胞的生物学功能和发育过程中的调控。他们发现骨腱界面纤维软骨细胞高表达与软骨发育、细胞外基质组织和生物矿化组织发育相关的基因，而干祖细胞高表达与成纤维细胞增殖和形态发生相关的基因。此外，他们使用单细胞调控网络推断和聚类分析（SCENIC）揭示了可能调控骨腱界面细胞分化的基因调控网络，其中发现了之前报道的韧带相关调控元素Sox9在骨腱界面纤维软骨细胞中显著表达。这些发现有助于理解骨腱界面纤维软骨细胞分化的生物过程和潜在调控机制（图3a-h）。

图3. 鉴定发现转录调控因子Sox9、Mef2a/c在纤维软骨细胞分化中具有重要作用。

文章结论与讨论，启发与展望

该研究联合采用单细胞测序与空间转录组测序绘制骨腱界面发育细胞图谱，是目前已知涵盖骨腱界面发育时间点最全的描述性研究，研究数据将成为探索骨腱界面细胞命运决定机制的重要资源。该图谱为人们对骨腱界面发育的机制理解提供重要帮助。