急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)是一种常见的肾功能迅速恶化危及生命的综合征，其发生可由多种因素引起，如脓毒症、肾脏缺血-再灌注损伤等。脓毒症是一种全身炎症反应，感染期间伴有器官功能障碍。脓毒血症引起的性急性肾损伤（S-AKI）患者的死亡率和慢性肾脏疾病进展均高于普通脓毒症患者。

 

细胞焦亡是一种受调控的细胞死亡，与细胞凋亡类似，细胞焦亡依赖于半胱天冬酶，但具有不同的成员。从机制上讲，细胞焦亡可以在典型炎性体途径或非典型炎性体途径中被激活。LPS直接结合并激活caspase 11(小鼠)或caspase 4/5(人)，导致GSDMD9的裂解。最后，断裂的GSDMD破坏细胞膜，诱导细胞死亡。细胞焦亡的发生与氧化应激状态密切相关，但其在S-AKI中的确切机制仍有待研究。

 

CHIP (Carboxy-terminus of Hsc70-interacting protein)是一种独特的具有伴侣活性的U-box E3连接酶，已经证实，CHIP泛素化和降解广泛的底物，参与多种生物过程的调节。在本研究中，我们提出了CHIP缓解S-AKI氧化还原损伤的初步证据，其有益作用与NLRP3的泛素化和细胞焦亡的减慢有关。

 

S-AKI是最常见的AKI类型之一，其发病机制与细胞焦亡和氧化应激密切相关。CHIP的羧基端是一种U-box型 E3连接酶，通过降解其靶蛋白来调节氧化应激。CHIP在S-AKI中的作用及其与细胞焦亡的相关性尚未被研究。在这项研究中，我们发现在脂多糖(LPS)诱导的S-AKI中，CHIP在肾近端小管细胞中下调。此外，CHIP过表达或激活会减弱S-AKI的氧化还原损伤程度，而CHIP基因破坏则会加重氧化还原损伤程度。在机制上，我们的研究表明，NLRP3与CHIP相互作用并被泛素化，促进其蛋白酶体降解，从而抑制NLRP3/ACS炎症小体介导的细胞焦亡。

 

●CHIP在S-AKI中表达下调

 

研究者通过RPKM值分析和qRT-PCR程序进行的初步研究表明，CHIP是肾脏和BUMPT细胞中表达量最高的U-box E3连接酶，并选择其进行进一步研究。使用LPS处理BUMPT细胞和C57/BL6J小鼠诱导S-AKI，探索CHIP的表达变化。研究表明，在LPS处理的BUMPT细胞和小鼠肾脏中，CHIP的表达明显降低，CHIP在肾近端小管中（Megalin红色）高表达，LPS处理后，其在肾近端小管中的表达会降低。

 

图1 CHIP在S-AKI中表达下调

 

●CHIP可缓解LPS诱导的BUMPT细胞氧化应激和损伤

 

通过慢病毒转染获得CHIP过表达BUMPT细胞，通过Cas9质粒介导的基因缺失建立CHIP敲除BUMPT细胞。通过MTT试验，LPS处理可能导致细胞活性降低，CHIP过表达减轻了细胞活性下降，但CHIP敲除加剧了这一情况；通过DHE染色和DCF染色检测ROS变化情况，LPS处理的BUMPT细胞ROS生成增加，并受CHIP表达的调节；GSH/GSSH比值中也观察到类似的情况。综上所述，这些数据表明，CHIP缓解了LPS处理的BUMPT细胞的氧化应激状态和细胞损伤。

 

图2 CHIP影响LPS处理的BUMPT细胞活性和细胞内活性氧水平

 

●CHIP缓解LPS诱导的肾脏氧化还原损伤

 

通过肾皮质内局部注射腺病毒调控CHIP的表达。H & E染色显示CHIP过表达缓解S-AKI的肾脏病理变化（主要包括肾小管扩张、管型形成和炎症细胞浸润）；通过DHE染色评估，LPS处理的肾脏中ROS生成增加，并且受CHIP调节；4-HNE染色和MDA水平显示，细胞内脂质过氧化过程也出现类似变化。研究者通过qRT-PCR检测LPS诱导的的KIM-1和NGAL(肾小管损伤标志物)mRNA水平变化，通过血清肌酐和尿素氮水平评价肾功能，S-AKI中KIM-1、NGAL、Scr和BUN含量明显升高，这一过程可因CHIP过表达而减轻。总之，这些数据表明CHIP在缓解小鼠的S-AKI。

 

图3 CHIP缓解LPS诱导的肾小管细胞氧化还原损伤

 

●CHIP缓解S-AKI中的细胞焦亡

 

已经证实细胞焦亡在S-AKI的进展中起着关键作用，因此，我们研究CHIP与细胞焦亡的相关性。研究者通过Western blot检测细胞焦亡相关标志物，包括GSDMD-NT、裂解caspase 1、pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18和IL-18。研究表明，在LPS处理的BUMPT细胞中，这些标记物可能被上调，CHIP敲除会增强这种上调，而CHIP过表达会减弱这种上调。IL-1β和IL-18在细胞焦亡过程中通过膜孔从细胞质中释放出来。因此，检测细胞培养液中IL-1β和IL-18的浓度。研究者的数据显示，LPS诱导的细胞培养基中IL-1β和IL-18水平的升高受到CHIP表达的调节。此外，在体内研究中也证明了CHIP能够缓解细胞焦亡。

 

图4 CHIP影响S-AKI中的焦亡相关指标

 

●CHIP与NLRP3相互作用

 

为了探索CHIP在S-AKI中调控细胞焦亡的机制，进行了STRING分析，结果显示CHIP可能与焦亡过程中被广泛研究的分子 NLRP3相互作用。通过CO-IP以确认它们的相互作用。Lps处理的BUMPT细胞中CHIP和NLRP3之间的相互作用减弱。截断CHIP (Flag-tag)和NLRP3 (Myc-tag)，进一步的CO-IP分析发现，CHIP TPR结构域和NLRP3的LRR结构域在它们的相互作用中发挥了重要作用。然而，研究者通过Gst-pull down实验，发现CHIP与NLRP3并不直接结合，在CHIP丧失与HSP70结合能力后，CHIP与NLRP3的相互作用消失，。综上所述，我们的数据显示CHIP的TPR结构域和NLRP3的LRR结构域之间的间接相互作用依赖于HSP70。

 

图5 CHIP通过HSP70与NLRP3相互作用

 

●CHIP泛素化NLPR3驱动其降解

 

研究显示，NLRP3在lps处理的BUMPT细胞和肾脏中表达上调。由于CHIP是E3连接酶，我们推测CHIP可能泛素化NLRP3以驱动其蛋白酶体降解。为此，研究者采用CHX抑制蛋白质合成。在CHX存在的情况下，CHIP过表达加速了NLRP3的降解。研究者还研究了NLRP3的泛素化状态。CO-IP数据显示，CHIP过表达促进NLRP3泛素化。CHIP(小鼠)的酶活性依赖于其H261位点(小鼠)。具有H261Q或K31A (HSP70对接位点)突变的CHIP不能使NLRP3泛素化。此外，进一步的研究表明，CHIP诱导NLRP3的K48泛素化，而不是K63泛素化。总之，这些数据表明，CHIP催化NLRP3的K48泛素化，加速其蛋白酶体降解。

 

图6 CHIP泛素化并降解NLRP3

 

文章结论与讨论，启发与展望

CHIP在S-AKI发病机制中的作用如下

(1)CHIP在S-AKI中下调

(2) CHIP通过缓解细胞焦亡减轻S-AKI

(3) CHIP与NLRP3相互作用并泛素化NLRP3，抑制细胞焦亡。

近端小管细胞特异性CHIP敲除小鼠未纳入此次的研究。因此，在体内研究中很难排除其他肾脏细胞的参与。在机制方面，本研究仅研究了K48和K63泛素化，CHIP与NLRP3的相互作用是否涉及其他类型的泛素化尚不清楚。