白纹伊蚊（Aedes albopictus）是登革热等蚊媒传染病（mosquito-borne diseases）的重要传播媒介[1]，也是全球最具入侵性的蚊种[2]。主要依赖化学杀虫剂的媒介控制是蚊媒传染病预防控制的主要策略。然而，化学杀虫剂的滥用和不恰当使用已经导致蚊虫广泛的抗药性问题[3-5]，蚊虫对杀虫剂抗药性的演化是多种机制共同参与导致的结果。陈晓光团队在之前的工作中[6]，揭示了白纹伊蚊电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channel，vgsc）基因F1534S突变在白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂代表性药物溴氰菊酯抗性产生初期发挥着关键作用，随后I1532T突变和代谢抗性也参与溴氰菊酯抗性。然而，这些机制对溴氰菊酯抗性演化的具体贡献和影响尚未阐明。
杀虫剂抗药性通常被认为是蚊媒传染病防控效果降低的原因，主要因为蚊虫抗药性阻碍了媒介种群密度的下降，增加了虫媒病毒的传播风险。然而，与抗药性相关的适合度代价（fitness cost）不仅会导致媒介种群的适应度下降[7]，而且还可能导致蚊虫对病毒的媒介能力（vector competence）下降[8, 9]，从而降低病媒传播疾病的风险[10]。因此，杀虫剂抗药性和适合度代价对媒介种群和公共卫生的双面影响亟需我们对相关因素进行确定和量化，以评估抗药性的发生和演化对媒介种群和疾病传播的综合影响，这对蚊媒传染病的媒介防控策略至关重要。
该研究利用代表性杀虫剂溴氰菊酯建立了敏感品系来源的白纹伊蚊抗药性演化模型，揭示了白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性演化的分子机制；利用媒介能量方程综合分析抗性水平、适合度代价以及对DENV-2的易感性，发现白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性的演化会增大其对登革病毒的传播风险，因此媒介密度的控制仍然是蚊媒传染病的首要目标。
作者通过溴氰菊酯筛选成功建立了实验室白纹伊蚊溴氰菊酯的抗性品系（Lab-R），在抗性演化的早期阶段观察到F1534S突变，随后在抗性演化后期检测到I1532T突变和代谢抗性（P450s、CCEs和GSTs）（图1A）。前期工作构建的F1534S突变杂合品系（F1534S’）和转基因F1534S突变纯合品系（F1534S），没有检测到代谢抗性（表1），用于评估F1534S突变对抗性进化的早期贡献。作者从实验室溴氰菊酯抗性品系的筛选第30代（Lab-R30）成功分离得到3个亚群R30-1532T、R30-1534S、R30和R30-M（图1B），分别代表不同的抗性机制（表1，图1D），用于评估靶标抗性（I1532T/F1534S）和代谢变化对抗性进化后期的贡献。
（图源：Guo Y,et al., BMC Biology, 2023）
（表源：Guo Y, et al., BMC Biology, 2023）
为了探究靶标抗性（I1532T/F1534S）和代谢抗性在抗性演化后期中的作用，作者对比分析了Lab-S、Lab-R30、R30-1532T、R30-1534S和R30-M对溴氰菊酯的抗性水平（图1C）和种群的适合度代价（图2）。生物测定结果显示，R30-1534S溴氰菊酯抗性最高（RR50=59.5，adult mortality=36.2%），其次为R30-M（RR50=34.0，adult mortality=38.6%）和Lab-R30（RR50=27.0，adult mortality=68.6%），R30-1532T抗性最低（RR50=17.5，成年mortality=40.0%）（图1C），R30-1532T的抗性水平低于 R30-1534S 的生测结果印证了前述的分子动力学模拟和分子对接结果[6]。从适合度代价的综合量化指标来看，R30-1534S的种群活力最低，其次为 Lab-R30、R30-1532T和R30-M（图2K）。综上，抗性水平最高的R30-1534S适合度代价最显著，抗性水平较低的R30-I1532T适合度代价较低，抗性水平较高的R30-M没有显著的适合度代价。这些结果证实，与野生型敏感品系相比，抗性品系具有显著的适合度代价，导致其种群适应性较低。
（图源：Guo Y,et al., BMC Biology, 2023）
基于R30-1534S显著性适合度代价的结果，作者对比分析了Lab-S、F1534S、F1534S’和S1534F的适合度代价（图3），以评估F1534S突变在抗性演化早期过程中的作用。溴氰菊酯敏感性恢复的S1534F生活史特征与Lab-S基本一致（图3）。与R30-1534S相似，溴氰菊酯高抗表型的转基因纯合子F1534S表现出最显著的适合度代价（图3），而同样具有溴氰菊酯高抗表型的突变杂合子F1534S’并没有显著适合度代价（图3），这可能是F1534S突变在抗性演化早期迅速在种群中传播的原因。
图3 F1534S突变对白纹伊蚊幼虫和成蚊的适合度代价
（图源：Guo Y,et al., BMC Biology, 2023）
作者通过白纹伊蚊vgsc基因F1534S突变和I1532T对蛋白构象的影响预测和对接分析发现，相比于F1534S突变，I1532T突变对VGSC蛋白构象和与溴氰菊酯结合的影响更小（图4A-E）。该结果与上述抗性生物测定结果一致，说明I1532T突变诱导的较低抗性水平可能是由于两种突变对VGSC与溴氰菊酯亲和性的影响不同。
在Lab-R的溴氰菊酯抗性演变过程中，I1532T首次检测后频率上升，F1534S开始下降[6]。这两种突变对雄性交配能力的影响可能是抗性群体频率变化的进化机制。对分别携带I1532T突变和F1534S突变的R30-1532T和R30-1534S进行雄蚊交配力竞争力评估，发现相比于R30-1534S雄蚊，R30-1532T雄蚊对雌蚊具有显著的交配成功率（图4G）。此外，还发现R30-M和R30-1532T两个品系适合度代价较低，在抗性种群中相较于其他基因型能优先完成雄蚊羽化，占据交配优势（图4H）。因此，R30-1532T雄蚊在抗性种群中比R30-1534S雄蚊更具显著的交配竞争力优势。
通过宿主搜寻试验发现，抗性表型品系的宿主搜寻能力稍弱于敏感品系，这其中R30-1534S的饱血率较高，定位耗时最短；F1534S的饱血率较低，耗时最长（图4J,K），该结果说明抗性对寻找寄主的相关行为存在不利影响。
作者对1532T/T1534F/F和1532I/T1534F/S两种基因型的成蚊进行配对，通过检测后代基因型发现，亲本1532I/T1534F/S的两个突变来源于互补的同源染色体（图4H）。由于在Lab-R中尚未发现1532I/T1534F/F基因型，因此提出在溴氰菊酯抗性演化过程中，I1532T是独立于F1534S产生的，导致在杂合型1532I/T1534F/S基因型中，I1532T突变始终伴随着F1534S。
图4 演化后期出现的I1532T突变比F1534S突变具有更强的选择优势
（图源：Guo Y,et al., BMC Biology, 2023）
为评价溴氰菊酯抗性进化过程中对DENV-2的敏感性，作者通过采集中肠、唾液腺和卵巢以检测各品系雌蚊对DENV-2的感染情况，发现10 dpi和14 dpi的卵巢和唾液腺的组织阳性率差异均无统计学差异，然而，除了R30-M，其他抗性品系（Lab-R、R30-1532T、R30-1534S和F1534S）的卵巢和唾液腺的组织阳性率均低于敏感品系Lab-S，并且R30-M的各组织阳性率与Lab-S差异不大，甚至更高（图5A-C）。抗性品系的阳性中肠和阳性卵巢的病毒拷贝数低于敏感品系，其中，14 dpi的F1534S阳性卵巢中病毒载量高于Lab-S（图5D,E）。抗性品系和敏感品系的阳性唾液腺中病毒拷贝数无显著差异（图5F）。
图5 白纹伊蚊敏感品系和抗性品系对DENV-2的易感性
（图源：Guo Y,et al., BMC Biology, 2023）
为了评估白纹伊蚊的溴氰菊酯抗性演化和适合度代价对登革病毒传播风险的影响，作者利用综合指标媒介能量（Vectorial capacity，VC）公式，将公式1[11-12]中的参数媒介密度（m）进一步细化为公式2，即雌蚊繁殖力（f）、发育率（DR）、溴氰菊酯杀虫剂暴露后的存活率（1-M）和发育时间（d）。
利用上述具有可比性的实验数据，通过公式1和公式2将白纹伊蚊溴氰菊酯抗性演化过程中的抗性水平和适合度代价进行量化（图6A），作者对媒介能量公式中的每个参数都进行了定义和描述（图6B）。结果发现，抗性品系的VC值均高于敏感品系Lab-S（图6A）。与Lab-S相比，除了无适合度代价、媒介能力较高的 R30-M 外，其他在雌蚊繁殖力（f）、发育率（DR）、叮咬率（a）、发育时间（d）、雌蚊寿命（1/g）、媒介能力（b）等适合度代价相关或被适合度代价影响的相关参数上处于劣势的抗性品系仍能获得较高的VC值，说明抗性演化赋予的高水平存活率（1-M）直接导致种群的高媒介密度（m），对抗性品系的高 VC 值有强大的贡献，足以克服适合度代价带给抗性种群的生存劣势（图6A）。随着白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性演化，抗性种群对DENV-2 的媒介能量升高，代谢抗性主导的R30-M媒介能量最高，这主要是由于其同时具有较高的抗性水平和最低的适合度代价（图6A）。
图6 白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性的发生和演化过程中不同品系的媒介能量（图源：Guo Y,et al., BMC Biology, 2023）
杀虫剂是控制媒介蚊虫种群密度的有效手段，但长期大量使用可引起蚊虫抗性的发生演化及适合度代价，其对媒介种群和蚊媒传染病防控的影响是复杂的。该研究利用实验室建立的代表不同抗性机制的实验室品系，对白纹伊蚊对溴氰菊酯的抗性演变、适合度代价及其对登革病毒媒介能量进行了系统的对比分析。结果发现，抗性产生初期，靶标抗性F1534S发挥着重要作用且伴随着显著适合度代价，此时抗性种群对登革病毒的媒介能力下降，蚊虫密度无法得到有效控制；随着抗性演化，种群演变出适合度代价较小的靶标抗性I1532T和代谢抗性，此时种群同时具有高抗性水平和稳定的媒介能力，导致种群对登革病毒的媒介能量增高、蚊媒传染病流行的风险加大。
本研究阐明了登革热重要媒介白纹伊蚊对代表性杀虫剂溴氰菊酯抗性演化的分子机制，评估了溴氰菊酯抗性演变、适合度代价对登革病毒媒介能量的综合影响。本研究的结果将对媒介蚊虫的杀虫剂使用、抗药性监测和管理、以及蚊媒传染病防控提供科学指引。
