揭示肉鸡体外肌纤维形成过程的可变剪接动态以及TRA2B的剪接调控作用

可变剪接（Alternative splicing，AS）是调控真核基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制之一。先前研究表明在禽类和人类中分别大约有60%和90%的基因受AS调控[1]。AS可通过使用不同的外显子组合产生不同的成熟转录本，从而产生具有不同结构的蛋白质亚型，并最终调节不同的细胞进程，如细胞增殖、分化和凋亡[2]。AS通常以细胞或组织特异性的方式发生。AS的调节主要由位于pre-mRNA中的顺式作用元件和剪接调控因子控制。在这些剪接调控因子中，富含丝氨酸/精氨酸蛋白（serine/arginine-rich proteins，SR）和异核质核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNP）家族是主要剪接调控因子。此外，多个RNA结合蛋白（RBPs），包括但不限于CELF、RBFOX1/2和MBNL家族，也参与AS调控。这些蛋白通过时期特异性表达塑造不同组织独特的RNA剪接模式。骨骼肌和大脑具有最丰富的可变剪接转录本[3]。AS的异常调节可导致神经肌肉疾病。其中，I型和II型肌强直性营养不良通常表现出AS异常[4]。肌纤维形成过程是影响人类和动物肌肉量的关键步骤，该过程受到大量基因的协同调控，但AS在其中的变化尚未有详尽的报道。因此，探究肌纤维形成过程中的AS调控图谱，对于深入认识胚胎期肌肉的形成、神经肌肉疾病的机理、以及畜禽产肉量都至关重要。

过去的短读长测序在鉴别不同转录本间相同的外显子区域或复杂剪接位点的组合方面存在局限性，这可能会限制对可变剪接转录本的鉴定[5]。三代全长转录本测序（Iso-Seq）通过获取完整的RNA分子结构，而无需进行组装，从而克服了短读长测序的局限性。这项技术为剪接异构体研究提供了重要支持，并可以显著提高现有基因模型注释的准确性。

通过利用基于PacBio平台的Iso-Seq，结合基于Illumina的短读测序和scRNA-seq，刻画了肉鸡肌纤维形成过程的AS调控图谱，并发现了RNA结合蛋白TRA2B存在两条差异剪接转录本。在成肌细胞分化过程中调控TGFBR2的剪接调控TGF-β信号通路，从而影响成肌细胞分化进程。

研究人员为了探究肌肉纤维形成过程中转录组的复杂性，分离了鸡原代肌肉组织，并将其培养在用于增殖的生长培养基或用于分化的分化培养基中，构建了三种分化时期的肌肉细胞样本（PM，GM和DM）。随后利用Iso-Seq和bulk RNA-seq对三个时期样本进行测序，质检后共获得461,494 consensus reads，平均读长超过2900 bp。经过SQANTI3过滤和异构体注释后，研究者构建了包含61146个高可信转录本，这些异构体对应于11682个表达基因（注释基因：10760[92%]；新基因：922[8%]；图1）。这些全长转录本中，约33%是完全匹配转录本（FSM），而超过52%转录本为新发现。此外，测序结果还鉴定到生肌转录调控因子MyoD1及重要调控因子PDLIM7新转录本。

图1. Iso-Seq和bulk-RNAseq的整合分析揭示肌生成中的转录组图谱

随后，研究人员利用获取的master transcriptome 进行可变剪接分析。SUPPA将所有的差异剪接转录本分为7种类型（图2），差异剪接结果表明在连续分化的两时期间，外显子跳跃是主要的剪接类型。联合差异表达和差异剪接分析表明只有少量差异表达基因与差异剪接基因重叠。差异剪接外显子motif分析结果说明RNA结合蛋白TRA2B是分化时期特异剪接的潜在调控基因。

图2. 肌源分化依赖的选择性剪接动力学与基因表达谱有显著差异。

随后研究团队对三个分化时期样本进行single-cell RNA-seq，鉴别到7种不同的细胞类型。对肌肉细胞亚群进行进一步分析，发现从肌肉祖细胞到成熟肌纤维等八种不同的细胞类群，并得到不同亚群的差异高表达基因。为了进一步获得细胞类群间的剪接差异，研究人员进行基于差异peak[6]和splice-junction[7]分析，结果发现在肌肉细胞亚群间，多数的可变剪接属于亚群转换。同时，亚群间差异表达基因和差异剪接基因重叠比例低。参与细胞骨架调控、膜转运和细胞周期调控的基因是肌肉细胞亚群间的主要差异剪接基因。研究人员对RBP在细胞亚群间的剪接分析中鉴别到TRA2B存在第二外显子跳跃（图3）。

图3. 细胞类型特异性选择性剪接事件塑造细胞身份并增强转录组多样性。

为了探究TRA2B差异剪接转录本（TRA2B-L和TRA2B-S）在肌肉发育中的作用，研究团队利用体外分离培养的成肌细胞通过过表达和干扰TRA2B特异亚型，发现TRA2B亚型是成肌细胞增殖和维持活性的必要因子，而在分化过程中分别抑制和促进肌源性分化。RIP-seq实验表明，TRA2B两个转录本编码的蛋白通过经典motif (5′-GAAGAA-3′) 结合到前体转录本的外显子区域。进一步，他们发现TRA2B-S亚型通过阻碍TRA2B-L全长亚型对TGFBR2的跳跃外显子剪接作用，抑制 TGFβ通路，最终增强肌源性分化程序。

文章结论与讨论，启发与展望

该项研究详细表征了肉鸡肌纤维形成过程的可变剪接调控图谱，揭示了大量新的可变剪接转录本，发现了差异剪切基因功能区别于差异表达基因，验证了可变剪接通过调控转录本类型而非基因表达来影响肌纤维形成。该项工作所构建的肌纤维形成过程的master transcriptome为系统了解肌纤维形成过程的分子调控提供了重要的数据资源，其中揭示的可变剪切调控机理和关键剪切因子也有助于进一步解析肌肉发育的遗传调控机制。未来需要进一步探究基因组变异如何影响RNA可变剪切，进而调控肌纤维形成和肌肉产量。