环状亚胺毒素的合成揭示其抗癌机制

环状亚胺毒素是一类具有大环和亚胺结构的天然海洋产物，具有独特的生物活性[1]。由于其阻断乙酰胆碱受体会产生高度的神经毒性，因而无法发挥其治疗潜能[2]。2013 年和 2018 年研究者从底栖鞭毛虫Vulcanodinium rugosum中分别离出来了两种环亚胺毒素portimine A (PA, 1) 和 portimine B (PB, 2) [3]。尽管PA与PB为一对互变异构体，两者的作用却显著不同。与传统的环状亚胺毒素相比，PA在多种癌细胞系中具有高度细胞毒性，但对生物个体的整体毒性较弱，显示出巨大的治疗的潜力。此外，PA还是一种新型的细胞凋亡诱导剂[4]。而PB却不具备有这些功能。是什么赋予PA强大的活性作用呢？底栖鞭毛虫数量有限，环亚胺毒素结构复杂及生物化学合成举步维艰等问题为探索其活性作用机制带来了巨大的挑战。

研究者通过构建最低限度氧化的碳框架，进行策略性氧化和环链异构化最终实现了PA和PB的全合成。这种大规模合成确保了原位和体内的精细研究。研究者利用化学蛋白质组学阐明了PA的细胞靶点，揭示PA能够靶向核糖体60S亚基输出蛋白 NMD3，阻断多聚体形成并抑制蛋白质翻译，发挥强大的抗肿瘤作用。

受萜类化合物的两相合成途径（two-phase strategy）启发，研究者以portimines的最小氧化大环中间体为目标，调整了合成氧化顺序。利用C-7/C-8上的炔基替代最终的C-7氧化，通过炔烃环合复分解反应（RCAM），最大限度地减少不稳定的官能团和后续（C-5、C-13、C-14和C-15）的氧化还原操作。反推在解开大环时，二烷基化前体3的简单构建模块（图1）。通过一系列反应最终成功合成PA、PB以及其他类似物。

图1.逆合成分析路线。

通过上述扩大合成，研究者接下来评估了PA在20种人类和小鼠肿瘤细胞系中的细胞毒性效应（图2）。数据表明在评估的整个癌细胞系中，PA具有持续有效的高细胞毒性（图2a-c）。而全合成的PB的毒性显著降低，PA的C-5差向异构体ePA也是如此。由此推断PA的的抗增殖活性取决于C-5的立体化学。除此之外苯基衍生物Ph-PA也显示出与PA相似的活性，表明末端乙烯基（C-21\/C-22）对观察到的生物活性不是必需的。在此基础上，研究者在PA的C-18位置引入含二氮杂炔（DA），构建差向异构体光亲和探针PA-DA和ePA-DA，作为后续靶标鉴定工具。实验证明，全合成的PA能诱导细胞凋亡和细胞周期停滞（图2d-f）。值得注意的是，PA不会诱导分离的人外周血单核细胞（PBMC）的凋亡，具有细胞选择性（图2g）。此外，在MC38小鼠结肠癌和HT-1080人纤维肉瘤肿瘤异种移植模型中，PA能有效抑制的肿瘤生长。

图2. PA及其功能类似物对癌细胞和体内肿瘤模型显示选择性急性毒性。

PA是如何影响癌细胞造成细胞死亡的呢？研究者通过TMT标记蛋白质组学鉴定出了PA的靶标——核糖体大亚基60S输出蛋白NMD3（图3a-b）。研究发现PA和NMD3间存在相互作用，这种作用具有强稳定性（图3d-e），正是这种作用赋予PA强大的活性。

鉴于NMD3是核糖体60S亚基单位输出的衔接子，是新生核糖体60S成熟所必需的。PA与NMD的作用是否会影响核糖体组装？研究者发现用PA处理的Jurkat和MC38细胞中，80S单体和二体显著积累，多聚体形成被阻断（图3h）。由于PA阻碍了多聚体的形成，在多种细胞系中，新蛋白质的合成呈现剂量依赖性抑制（图3i）。翻译抑制是几种细胞毒性天然产物的共同机制。研究者通过对原癌蛋白MYC和抗凋亡蛋白MCL-1表达水平及转录水平评估发现，用PA处理的Jurkat和MC38细胞中MYC和MCL-1蛋白含量快速降低，而mRNA水平几乎不变。相较于正常细胞而言，癌细胞具有异常高水平的MYC和MCL-1，因此， PA对癌细胞选择性作用源于阻断维持癌细胞生长和至关重要的半衰期较短的蛋白质的翻译。

图3. PA靶向NMD3，阻止多聚体形成并抑制蛋白质翻译。

文章结论与讨论，启发与展望

综上，研究者利用萜类化合物的两相合成途径，搭建了一个装饰最少的碳骨架，调整氧化顺序，并通过战略性定时的环链互变异构化实现了大环和亚胺结构的嵌合。最后，引入稳定的三氟甲磺酸乙烯酯，使这种具有生物前景的先导化合物能够灵活多样化，从而构建用于目标识别研究的光学探针。研究者证明全合成的PA对癌细胞具有高度的细胞毒性，但在人类PBMC中不具有细胞毒性，具有显著的选择性。此外，化学蛋白质组学研究表明，NMD3是PA的主要靶标， PA与NMD3的结合导致80S的稳定，随后破坏多聚体的形成和抑制蛋白质合成，导致细胞周期停滞和凋亡。然而，PA与NMD3结合如何诱导这种级联反应的确切分子机制仍有待补充，并将成为未来研究的主题。与其他小分子翻译抑制剂类似，在癌症细胞（而不是PBMC）中观察到的有效作用的一种可能解释是PA阻断了对增殖和存活至关重要的“短寿”蛋白如MYC和MCL-1表达。然而， PA对NMD3和翻译的影响可能还会影响其他多种生存途径，并因细胞类型和相关遗传病变而有所不同。因此，需进一步的研究，评估导致携带此类基因表达失调的恶性肿瘤是否对PA表现出更高的易感性，以及PA是否可能与靶向治疗协同作用，以实现更高的选择性和疗效。总之，该研究证明根据理想性标准设计的全合成路线，结合强大的化学蛋白质组学方法能识别潜在的治疗靶点，为癌症的治疗开辟了一条新途径。