单微粒样本作为流式细胞术三要素之一，制备不好对结果的影响会非常大，我们今天就以外周血和新鲜实体组织为例聊聊吧。
外周血单个核细胞样本的制备
血液中的主要成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。一般检测细胞大分子成分——DNA、RNA、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等，外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细胞表面标志检测可采用溶血细胞法。
方法一制备程序：
•取外周血2 mL，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 mL，混匀；
•将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4 mL淋巴细胞分离液（GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02）到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；
•室温离心2000 rpm，30min，离心后可见试管内的血液清楚的分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞处于血浆层和分离液层中间）底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；
•用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另一试管中，用生理盐水洗2遍，每次均以1500 rpm，10min，弃上清后加少许生理盐水，混匀即得到高纯度的单个核细胞悬液；
•70%冰乙醇固定细胞或低温保存备用。
方法二制备程序:
•取柠檬酸抗凝的100 μL全血，加入流式管中，加入2 mL 1x红细胞裂解液（BD #555899），室温裂解15-30 min，直至细胞悬液澄清透明；
•裂红后，300 g，5min离心，弃上清；
•用2 mL预冷的PBS清洗2次，300 g，5min离心，弃上清；
•加入100 μL PBS或者1x binding buffer重悬细胞，得到单细胞悬液；
直接开始染色步骤或70%冰乙醇固定细胞或低温保存备用。
Tips：后续做活细胞检测时，请勿固定。
新鲜实体组织样本的制备
目前常用的分散实体组织细胞的方法有3种：
1. 酶消化法：破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等物质，水解粘多糖以及起黏连作用的蛋白等物质。常用于实体瘤和培养细胞。
常用的酶类试剂有：
▲蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞；
▲胰蛋白酶能水解脂键和肽键；
▲胶原酶能降解几种分子类型的胶原；
▲溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；
▲弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同的酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
方法程序：
•将组织置于离心管中；
•加入选好的酶溶液1-2 mL；
•一般消化20-30 min（恒温37 ℃或室温），消化期间要间断震荡或吹打；
•终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞碎片；
•将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。
2. 机械法：分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。但机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。
1）剪碎法：
•将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水，用剪刀将组织剪至匀浆状；
•加入10 mL生理盐水，用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
•离心沉淀1000 rpm，3-5 min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800 rpm）短时离心沉淀去除细胞碎片；
•以300目尼龙网滤去细胞团块；
•70%冰乙醇固定细胞或低温保存备用。
2）网搓法：
•将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；
•把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
•收集细胞悬液，500-800 rpm离心沉淀2 min；
•以少量生理盐水重悬；
•70%冰乙醇固定细胞或低温保存备用。
3）研磨法：
•将组织剪成1-2 mm3大小组织块放入组织研磨器中，加入1-2 mL生理盐水；
•转动研棒，研至匀浆，加入10 mL生理盐水，冲洗研磨器；
•收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，500-800 rpm离心沉淀1-2 min，再以生理盐水洗3遍，离心沉淀，以少量生理盐水重悬；
•70%冰乙醇固定细胞或低温保存备用。
3. 化学处理法：将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
1）试剂的配制：
•0.2% EDTA配制：称EDTA 0.2 g，加入Hank’s液100 mL，封装高压消毒，置4 ℃保存；
•胰酶加EDTA配制：胰酶0.25 g加PBS（pH7.0）200 mL，浓度0.125%，EDTA 0.2 g加PBS（pH7.0）100 mL，浓度0.2%。各取40 mL混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可。
2）实验方法：
•将组织切成薄片，置入试管中，首先加入EDTA液5 mL，室温下0.5 h，离心弃上清；
•再加入胰酶-EDTA液5 mL，在37 ℃恒温水浴振荡器内30 min；
•用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000 rpm，5 min，再以生理盐水洗2-3次，以少量生理盐水重悬；
•70%冰乙醇固定细胞或低温保存备用。
后续我们会继续讲解组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬液样本的制备，石蜡包埋组织样本的制备，骨髓细胞单细胞悬液样本的制备，培养细胞的单细胞悬液样本的制备和脱落细胞样品单细胞悬液的制备。
