细胞迁移和增殖的评估在肿瘤学领域至关重要，已被广泛用于癌症预后和治疗结果的预测[1]。通常，迁移和增殖这两个过程的定量分析是在群体水平上进行的，例如MTT实验、CCK-8实验、划痕实验等[2, 3]。但上述方法通常只能得到群体水平的平均结果，一些重要的个体信息将被掩盖。为了破译细胞异质性，鉴定细胞亚型并揭示单个细胞的独特性质，研究者们已经提出了单细胞分析作为替代方案[4]。然而，传统的单细胞分析通常将细胞以低密度接种在孔板或培养皿中，再通过显微镜成像监测以跟踪单个细胞的迁移和增殖，其通量较低。近年来，微流控技术的发展使得人们能够以更高通量在单细胞水平评估细胞的迁移和增殖，从而获得有关细胞异质性和亚型的独特信息[5]。然而，由于芯片结构缺陷或缺乏用于高速数据分析的模块，当前大多数平台的通量有限，极大阻碍了统计无偏性生物数据的提取。因此，开发一种可用于单细胞长期培养和高通量单细胞迁移和增殖行为分析的系统具有重要意义。该研究提出了一种高通量系统，该系统由可寻址的双嵌套微孔阵列芯片（DNMA芯片）和基于人工智能（AI）的图像分析算法组成。其中，DNMA 芯片可实现单细胞的捕获、无标记编码和长期孵育。结合AI辅助数据处理，能够以高通量和非破坏性的方式定量分析正常培养或药物处理的单个肿瘤细胞的迁移和增殖情况。
首先，研究者设计、制造和表征了可寻址DNMA芯片，并验证了该芯片可用于单细胞捕获。芯片设计是基于在流体冲洗作用下，上部微孔中的细胞将被冲洗除去，而下部微孔中的细胞可以被保存的猜想（图1A）。为了验证这一假设，研究人员先对流体冲洗过程进行仿真，发现在不同条件下，被困在上部微孔中的细胞比下部微孔中的细胞更容易被冲洗掉（图1B）。研究者首先选择荧光微球作为模型进行研究，结果与预期一致（图1C）。他们还研究了粒径、离心力和颗粒浓度对单细胞捕获效率的影响，筛选出最佳捕获条件（图1D）。接着，以HCT116细胞为模型对DNMA芯片进一步测试，发现在用微球筛选的最佳条件下，HCT116的单细胞占用率和活性分别达到35.0%±18.2%和98.3% ± 3.4%（图1E-1F），证实了DNMA芯片用于单细胞分析的可行性。
图1 验证用于单细胞捕获的DNMA芯片
（图源：Lu Hang et al., CRPS, 2023）
接下来，研究人员分别研究了正常培养和药物处理的DNMA芯片上HCT116细胞的迁移情况（图2-3）。由于实验中产生了大量图像，他们开发了一种基于深度学习的高通量图像处理方法（图2A）。经过训练后，深度学习模型的细胞识别精度高达92.4%±2.7%，图像处理速率高达每分钟3,600张显微照片。利用该深度学习模型，图像中的细胞可被识别及分割。该程序进一步从图像中提取细胞坐标，并为其对应像素分配值 1，图像中属于背景的其余像素被赋予值 0。通过绘制索引图像使细胞位置可视化，在此基础上计算索引图像的归一化像素值以估计给定时间双嵌套微孔中任何位置细胞出现的概率。
正常培养下（图2），通过深度学习，研究者计算了平均迁移距离（即细胞最终位置和初始位置之间的距离的平均值）（图2C），并将归一化索引图像表示为热图（图2D）。研究结果表明，细胞倾向于向上层微孔边缘处迁移，这可能是由微孔中的营养物质浓度梯度造成。该结果暗示肿瘤微环境中微小的营养物质浓度梯度可能在癌症的侵袭和迁移中起着至关重要的作用。
在药物（顺铂）处理下进行同样的分析（图3）。研究结果表明，所有单细胞在开始时（0小时）都驻留在下层微孔中，且大多数细胞在96小时后仍保留在原始位置。该结果与在正常培养下48小时开始增殖并移出下层微孔的情况形成鲜明对比，验证了顺铂的抗肿瘤功效。此外，研究者发现极少数单细胞即使在药物作用下仍可增殖并迁移到上层微孔区域。值得注意的是，这些耐药细胞也倾向于聚集在上部微孔的边缘和角落。上述结果证明了AI-DNMA在发现肿瘤细胞群中稀有耐药细胞个体的能力，有助于了解某些疾病的未知机制。
图2正常培养下DNMA芯片上的单细胞迁移
（图源：Lu Hang et al., CRPS, 2023）
图3 药物处理下DNMA芯片上的单细胞迁移
（图源：Lu Hang et al., CRPS, 2023）
细胞增殖可以反映细胞的健康状况，或用作评估细胞对外部刺激（如药物）的反应的可靠指标[6]。研究者使用光学显微镜分别研究正常培养和药物处理的DNMA芯片中的单细胞增殖（图5-6）。
正常培养下，研究人员拍摄了单细胞的五个代表性微孔的明场图像（图4A），量化了200多个单细胞的细胞数量随时间的变化（图4B），定量分析了肿瘤细胞在单细胞水平上的增殖速度、倍增时间（DT）和表观初始数量（N0）(图4C)，验证了芯片上细胞的密度对细胞增殖的影响，并评估了单个肿瘤细胞的恶性程度（图4E-4F）。这些结果表明，AI-DNMA可以区分不同恶性程度的肿瘤细胞，显示了其在单细胞水平上对切除的肿瘤样本进行预后分析的巨大潜力。
在药物（顺铂）处理下进行同样分析（图5），研究结果表明，顺铂处理后的单细胞总体上表现出更低的增殖活性，并显示出不同的个体增殖特征。该方法可用于发现肿瘤细胞群中的稀有耐药性细胞，且与其他下游表征方法结合时有助于揭示疾病机制。
图4 正常培养下DNMA芯片上单细胞增殖的分析
（图源：Lu Hang et al., CRPS, 2023）
图5 药物处理下DNMA芯片上单细胞增殖的分析
（图源：Lu Hang et al., CRPS, 2023）
利用AI-DNMA，研究者以非破坏性和高通量的方式分析了HCT116细胞在正常培养或药物处理下的单细胞迁移和增殖。如上所述，这种策略不仅揭示了单个细胞之间的独特特征，而且还揭示了它们集体行为的差异。总体而言，正常培养下的细胞群比药物处理的细胞群具有更高的平均迁移速率和增殖速率，这意味着顺铂可能已经诱导了群体水平的细胞表型变化。为了验证该推测，他们对不同条件下的细胞群进行了转录组分析（图6）。研究结果表明，顺铂通过激活HCT116细胞中的p53信号通路成功地抑制了细胞的增殖和迁移。此外，他们发现大量参与DNA修复的基因，如DDB2、MDM2、P21等，也显著上调。他们认为，负责DNA修复的基因的激活是HCT116细胞对顺铂的应激反应，与此前其他研究人员报道结果吻合[7, 8]。转录组结果表明了顺铂诱导了群体水平的细胞表型变化，验证了利用AI-DNMA进行单细胞增殖及迁移行为分析的可行性。
图6 细胞群转录组学分析
（图源：Lu Hang et al., CRPS, 2023）
总言之，AI-DNMA为高通量单细胞迁移及增殖行为分析提供了一个有效的平台，不仅可以帮助揭示单个细胞之间的独特性质，还可以研究它们的集体行为。这样的平台将在单细胞水平研究不同生物过程方面具有广泛应用。
