揭示范可尼贫血通路关键成员FAAP100调控生殖储备建立新机制

原始生殖细胞（primordial germ cells, PGC）是配子的前体细胞，通过有丝分裂增殖产生的PGC群体是生殖储备建立的基础，对于配子发生以及物种繁衍至关重要。PGC基因组稳定性的维持是物种遗传信息稳定传递的前提，DNA损伤修复通路基因在其基因组稳定性的维持中发挥重要作用。其中，范可尼贫血（Fanconi anemia，FA）通路是经典的DNA损伤修复通路，该通路基因突变引起范可尼贫血综合征，通常伴有生殖障碍。既往动物模型研究表明，FA通路与PGC发育密切相关。FAAP100是FA通路的关键成员之一，与FANCB及 FANCL共同组成FA核心复合体E3泛素连接酶的催化模块，从而泛素化 FANCI-FANCD2复合体，对于FA通路的激活必不可少。但是，FAAP100在PGC发育中的作用尚不清楚。

该研究首次报道了FA通路关键成员FAAP100通过解除R-loop和保护复制叉两个功能来应对转录复制冲突（transcription-replication conflicts，TRC），以保障PGC基因组的高度稳定性以及生殖储备的建立。

为探究FAAP100在PGC发育中的具体作用，研究者应用CRISPR/Cas9技术构建Faap100基因敲除小鼠。首先对小鼠卵巢的功能及形态学进行了观察，发现Faap100^-/-成年雌鼠出现动情周期紊乱、血清FSH水平升高、卵巢萎缩和卵泡耗竭等卵巢早衰表型。3天龄Faap100^-/-雌鼠卵巢中的原始卵泡数目及雄鼠睾丸生精小管的生殖细胞均显著减少，提示胚胎期生殖细胞发育异常。通过观察胚胎性腺，发现Faap100^-/-PGC在胚胎8.5天（E8.5）时数目无明显异常，E9.5时开始减少，E11.5时明显减少（图1）。上述结果表明FAAP100在PGC的发育过程中发挥重要功能。

图1 Faap100基因敲除导致小鼠PGC发育障碍

进一步发现E11.5 Faap100^-/-胚胎PGC凋亡增加，增殖能力下降，发生G2期阻滞，而转录激活及表观遗传重编程过程未见明显异常。结合体内外研究发现，Faap100基因敲除导致FA通路激活障碍，DNA损伤增加，p53过度激活，通过p53基因敲除可部分挽救Faap100^-/-胚胎PGC的减少。上述结果表明Faap100基因敲除导致FA通路失活引起DNA损伤增加并激活了p53通路。

最后研究者对PGC内源性DNA损伤的来源进行了探索，发现Faap100^-/-小鼠胚胎PGC中TRC增加，R-loop累积（图2），表明FAAP100缺陷引起内源性复制压力解除障碍导致PGC基因组不稳定和增殖障碍。体外研究发现Faap100^-/-小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）中R-loop累积，TRC增加，复制速度减慢；而过表达RNase H1解除R-loop后，TRC的发生频率下降，复制速度部分恢复，DNA损伤减少，表明Faap100^-/-MEF中累积的R-loop加剧了TRC，进而导致基因组不稳定性增加。此外，应用药物诱导复制压力后，Faap100^-/-MEF中新生DNA链变短，表明Faap100基因敲除导致新生的DNA链被核酸酶降解，复制叉不稳定性增加。以上结果表明，FA通路通过解除R-loop和保护复制叉两个机制应对PGC中的TRC，从而维持PGC的快速增殖。

图2 Faap100基因敲除引起小鼠PGC中TRC和R-loop增加

图3 FAAP100解除PGC中TRC从而保障生殖储备建立的机制模式图

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究发现FAAP100通过解除R-loop和保护复制叉来应对TRC，从而维持PGC基因组稳定性，保障其快速增殖以及生殖储备的正常建立；Faap100基因缺失引起FA通路失活，TRC及R-loop增加，复制叉不稳定，导致DNA损伤增加和p53激活，进而引起PGC增殖缺陷和生殖储备建立不足（图3）。本研究揭示了FAAP100在解除PGC内源性基因组威胁中的重要作用，证实了基因组不稳定引起的PGC发育障碍是影响生殖储备建立的重要原因。