多色流式 

顾名思义，多色流式指同一个样本中同时有多个颜色，即同时标记多个指标。为什么要多个指标一起检测呢？怎么操作呢？跟着小敏一起来了解一下吧。

 

 

 

 Features 

●  一份样本

●  多个参数

●  可用于表面抗原检测，对细胞进行分型

●  可用于胞内细胞因子检测，研究细胞的生物特     性

 Advantage 

▲ 节约样本，尤其是样本很稀有时

▲ 所有参数来自同一样本，减少样本自身、操作、时间等带来的误差

 Benefit 

✦  大大节省实验者的实验成本（时间、精力、经费等）

✦  可检测指标在细胞上共表达的情况

 

 

 

一、Fc受体阻断 

▲ 小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block，#553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。在100 μL 染色缓冲液（BD #554656）中加入2 μL BD Fc Block/10^6细胞，4 ℃孵育15 min。随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer适当稀释）；

▲ 对于人类细胞，可提前将细胞与人血清或过量的同种属不相关纯化Ig共同孵育，并加入同型对照以阻断Fc受体；

▲ 大鼠中，用特异性针对FcgII受体的D34-485纯化抗体（BD Fc Block，#550270 或550271）阻断荧光抗体Fc受体介导的非特异性结合。1x10^6细胞重悬于100 μL Staining Buffer中，加入1 μg BD Fc Block，4 ℃ 孵育15 min。随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用Staining Buffer适当稀释）。

 二、细胞表面染色 

A.PBMC染色

▲ 用80-100 μL Staining Buffer重悬1x10^6细胞，加入适量的特异性单克隆表面抗原荧光抗体（此步亦可将抗体用stain Buffer制备成预混合物，染色终体积为100 μL），如CD3，CD4，CD8，CD14，CD19等，充分混匀后常温避光孵育15-20 min或4 ℃避光孵育30 min；

▲ 加入1 mL Staining Buffer清洗细胞2遍，300 g离心5 min，离心后不要晃动样本管，倾倒液体时倒干净，用吸水纸吸掉管口液体，用最后回流的液体充分分散细胞沉淀（下同）；

▲ 用300-500 μL Staining Buffer重悬细胞，尽快上机检测。

 

B.全血染色

▲ 取100 μL全血到流式管中，加入适量的特异性单克隆表面抗原荧光抗体，如CD3，CD4，CD8，CD14，CD19等，充分混匀后常温避光孵育15-20 min或4 ℃避光孵育30 min；

▲ 加入1 mL Staining Buffer清洗细胞2遍。

Tips：新批次号抗体第一次使用时建议做一次抗体滴定，以得到染色效果最佳时的抗体用量。

 

全血等含红细胞的样本需要裂解红细胞：

● 表面抗原染色孵育时取出4 ℃保存的裂红液（BD #555899），按裂红液：蒸馏水= 1：9稀释，稀释液使用前需预热到室温；

● 100 μL全血最少加入1 mL 1 ×裂红液，室温避光孵育10-15 min，至上清液澄清透明；

● 常温300 g离心5min，弃上清；

● Staining Buffer清洗细胞2遍；

● 用300-500 μL Staining Buffer重悬细胞，尽快上机检测。

 三、核酸染料排除死细胞 

▲ 开始实验时准备好55 ℃水浴锅，抗体孵育时将核酸染料单染管细胞水浴5-10 min诱导死亡，此条件下约半数细胞死亡；

▲ 上机检测前向核酸染料单染管和样本管中加入适量核酸染料，10 min后直接上机，无需再洗涤。

 

 

 

 多色流式胞内染色流程 

胞内细胞因子检测相比于表面抗原检测操作步骤复杂一些，对样本制备的要求更高。

 

 

 

 

 一、细胞因子刺激 

PBMC细胞因子刺激

▲ 将1 mL PBMC细胞悬液（浓度1×10^6/mL）转移到流式管中（6孔板可能会有细胞贴壁，离心管不要盖紧管盖，流式管盖可选择不盖）；

▲从-80 ℃取出分装的刺激剂（BD #550583），37℃水浴快速解冻（体积小时也可手心捂住融化）；

▲ 每1 mL细胞悬液加入2 μL刺激剂，充分混匀后放到37 ℃ 5%二氧化碳培养箱中培养4-6h（刺激时间不确定时可设定2 h、4 h、6 h等不同的刺激时间），注意刺激中途不需要吹打混匀；

▲ 刺激完后收集细胞到流式管，加入1-2 mL Staining Buffer（BD #554656），清洗2遍。

Tips：

1.胞内细胞因子刺激时需加上蛋白转运抑制剂，以抑制刺激产生的细胞因子被转运到胞外；

2.刺激方式有很多种，以上方法适用于部分细胞因子或制备阳性对照样本，谨慎选用。需要了解其他刺激方法的老师请评论区留言，小敏将在下期整理推送。

 二、FVS死活染料染色 

A：FVS染色液的配制及保存

● 配制原液：将FVS粉末与适当体积（参见产品说明书）的DMSO恢复至室温，将DMSO与FVS粉末混合后充分涡旋，直至粉末完全溶解；

● 保存：干粉保存于-80 ℃，DMSO复溶液保存于-20 ℃，干粉最多支持4次冻融循环，DMSO复溶液最多保存40天，建议分装保存或复溶。

 

B：FVS染色液的染色流程

● 使用不含叠氮化钠的缓冲液制备单细胞悬液；

●用不含FBS和叠氮化钠的Dulbecco's Phosphate Buffer Saline（1x DPBS）清洗细胞2遍（刺激后的细胞直接用不含FBS和叠氮化钠的1x DPBS清洗两遍）；

● 将细胞以1-10 x 10^6 cells/mL的密度重悬于不含FBS和叠氮化钠的1x DPBS中；

● 按照1 mL细胞悬液加1 μL FVS染色液的比例加入，并立即涡旋混匀；

● 2-8 ℃避光孵育20-30 min（小鼠细胞）或37 ℃避光孵育5-7 min（Phosflow相关应用）；

● 染色好的细胞使用含有蛋白（FBS）的Staining Buffer（BD #554656）2 mL进行清洗；

● 离心后弃去上清液，轻柔混合，避免细胞结块；

● 将细胞重悬于Staining Buffer中，进行后续染色。

Tips：

1.区分死活后阴阳性比例细胞群比例相差较大，小敏建议各位老师要做这一步哟；

2.步骤中活死染料品牌为BD，其他品牌也有活死染料，原理类似，可参照说明书使用。

 三、细胞表面染色 

A：阻断Fc受体

▲ 参照多色流式表面染色流程

 

B：细胞表面染色

▲ 用80-100 μL Staining Buffer重悬1x10^6细胞，加入适量的特异性单克隆表面抗原荧光抗体（此步亦可将抗体用stain Buffer制备成预混合物，染色终体积为100 μL），如CD3，CD4，CD8，CD14，CD19等，充分混匀后4 ℃避光孵育30 min（与只做表面染色的样本孵育条件不同）；

▲ 加入1 mL Staining Buffer清洗细胞2遍。

 四、细胞固定、破膜 

A:染色后直接上机检测

▲ 细胞分散后，从4 ℃拿出固定破膜试剂（BD #554714），取250 μL Fix/Perm Solution到流式管中，充分混匀，4 ℃避光孵育20 min；

▲ 用1 mL 1x Perm/Wash Buffer清洗细胞2遍，弃掉上清。

 

B：样本过夜后上机检测

1.细胞固定与保存

▲ 100 μL 4%多聚甲醛（1 mL/10^7细胞）重悬细胞，4 ℃孵育 10-20 min；

▲ Staining Buffer清洗细胞2遍；

▲ Staining Buffer重悬细胞，4 ℃保存72 h；或用细胞冻存液（90% FBS/10% DMSO）重悬细胞，-80 ℃长久保存。

 

2.对已固定的细胞进行破膜 

▲ 对于冻存细胞，用Staining Buffer清洗2遍去除 DMSO，离心后去除 staining buffer；

▲ 对于 4 ℃保存的细胞，直接离心后去除 staining buffer；

▲ 将细胞重悬于1 mL Perm/Wash buffer，4 ℃孵育 15 min，离心去上清； 

▲ 用1 mL 1x Perm/Wash Buffer清洗细胞，弃掉上清。 

Tips：胞内、核内以及磷酸化细胞因子检测所需的固定破膜剂不同，可参照试剂说明书使用。

 五、胞内染色 

● 经过Perm/Wash buffer清洗、离心、去上清后的细胞用80-100 μL 1x Perm/Wash Buffer重悬细胞，加入适量的特异性单克隆胞内抗原荧光抗体（此步亦可将抗体用Perm/Wash Buffer制备成预混合物，染色终体积为100 μL），混匀后4 ℃避光孵育30 min；

● Staining Buffer清洗2遍，弃掉上清；

● 用300-500 μL Staining Buffer重悬细胞，尽快上机检测。