肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国高发的死亡率较高的恶性肿瘤疾病之一，是由多因素导致的从肝炎到肝纤维化、肝硬化，最后发展成肝癌的漫长过程。针对于肝癌潜在治疗靶点，通常需要在转基因小鼠水平进行功能与机制验证。然而，单一基因介导的小鼠肝癌生成周期较长，通常需要观察300-500天（致癌性较强的KRASG12D突变转基因小鼠也需要观察250-300天），这给科研工作者带来了很大的经济负担与时间压力，限制了转基因小鼠模型应用于新目的基因的功能验证，导致生物学结果的局限性。如何有效缩短肝癌进展观察周期仍然存在难点。
该文章介绍了一种经过优化的化学药物加速转基因小鼠肝癌生成的模型，优势在于可以加快HCC的进展，缩短肿瘤周期的观察时间，从300-500天缩短到180天。
该实验方案中，研究人员提供了详细的实验准备工作和操作细节。以新基因FBXO45为例，通过药物诱导的方式在FBXO45转基因小鼠水平探索了FBXO45在肝癌发生中的作用。首先作者利用CRISPR/cas9的基因工程技术生成了FBXO45高表达的转基因小鼠（FBXO45-OE），然后在2周龄时单次注射二乙基亚硝胺（DEN），从8周龄开始连续14周重复注射四氯化碳（CCl4）。发现与对照组野生型小鼠相比，FBXO45-OE小鼠生成了更多的肿瘤，并且肝脏重量增加（图1A-1C）。接着通过实时荧光定量PCR、组织学和免疫组化方法进行病理评估，结果表明FBXO45-OE小鼠肝脏中纤维化和炎症相关基因以及细胞增殖标志物Ki67的表达显著增加（图2A-2C）。因此，FBXO45作为致癌基因促进了肝癌发生。
图1.小鼠肝脏的代表性图像以及肿瘤统计图表
（图源：Zhang J et al., STAR Protoc, 2023）
图2.实时定量PCR和FBXO45/Ki67信号的IHC染色分析
（图源：Zhang J et al., STAR Protoc, 2023）
为了更好的观察炎症、纤维化和肝肿瘤的发展阶段，作者监测了DEN/CCl4治疗期间的小鼠肝脏样本的病理变化，在注射CCl4的第6、14周以及CCl4治疗的第14周+6周的观察期后收集肝脏组织进行组织学染色分析。正常情况下，小鼠肝细胞排列整齐，染色均匀，细胞核色深而清晰，而结果显示，与对照组相比，FBXO45-OE小鼠在CCl4治疗的第6周时肝细胞出现肿胀，坏死和凋亡，并伴有广泛的炎症细胞浸润；另外CCl4治疗第14周时FBXO45-OE小鼠组肝小叶结构被破坏、间隔增厚，形成假小叶，可见到胶原纤维异常沉积；同样的在CCl4治疗的第14周+6周的观察期后，FBXO45-OE组肝细胞排列较对照组更为紊乱，有明显的异质性，呈块状分布（图3）。这些结果表明在肝脏肿瘤发生的过程中，FBXO45会加速炎症和纤维化的进程。总的来说，通过调节化学药物处理时间长短，可以观察到肝炎、肝纤维化、肝癌进展的不同阶段，这为目的基因的功能研究提供更多选择。
图3.FBXO45对DEN/CCl4处理的小鼠组织学变化的影响
（图源：Zhang J et al., STAR Protoc, 2023）
图4.利用DEN/CCl4联合治疗诱导FBXO45-OE肝癌小鼠模型的实验方案
（图源：Zhang J et al., STAR Protoc, 2023）
