线粒体是真核生物细胞中广泛存在的一种重要的细胞器，参与多种生命活动进程，是细胞物质代谢和能量代谢的重要场所，被形象地称为细胞“动力工厂”。线粒体中大约有1100多种蛋白，分布在线粒体外膜、膜间隙、内膜及基质中。线粒体蛋白直接或间接参与调节线粒体生物学合成、动力学、能量转换及细胞程序性死亡等功能。目前已有许多对线粒体蛋白组学的研究，但是多数蛋白质在线粒体的亚定位并没有明确解析。因此，当前急需一个系统的方法提取线粒体并对线粒体蛋白进行亚定位，从而使研究者对线粒体蛋白如何影响线粒体功能有更深入的了解。

线粒体蛋白定位存在两种不同的划分依据：根据线粒体的功能区可以将线粒体蛋白分为外膜蛋白，内膜蛋白，膜间隙蛋白与基质蛋白；根据线粒体蛋白膜蛋白与膜的结合与否及分离的难易程度可将线粒体蛋白分为外在膜蛋白，内在膜蛋白，可溶性蛋白。由于内在膜蛋白与线粒体膜紧密结合不易破坏，因此需要通过有较强破坏力的洗涤剂来破坏蛋白与膜的联系。而与膜结合疏松且较易处理溶解到溶液中的蛋白称为外在膜蛋白。位于膜间隙与基质的蛋白因未与膜结合则称为可溶性蛋白。

在本实验方案中，研究者采用超声处理粗提线粒体，通过离心将膜蛋白（外在膜蛋白与内在膜蛋白）沉淀下来，使可溶性蛋白溶于上清。同时，通过破坏力较强的碳酸钠处理粗提线粒体，来沉淀内在膜蛋白，从而将外在膜蛋白与可溶性蛋白收集于上清。结合上述实验，可区分膜蛋白中的内在膜蛋白与外在膜蛋白。此外蛋白酶K与Triton X-100实验可区分出外膜蛋白。综上，可以细致地区分出外膜蛋白的外在膜蛋白与内在膜蛋白。

图1 粗提线粒体及线粒体蛋白细胞亚定位的实验方案

（图源：Zhou et al., STAR Protoc, 2023）

作者在最后分别展示了用三种方法对已知定位的线粒体蛋白进行亚定位。TOM40, TIM29, HSP60与 CytC分别代表外膜蛋白，内膜蛋白，基质蛋白及膜间隙蛋白，且可知TOM40与TIM29是膜整合蛋白。

图2 利用超声、碳酸钠和蛋白酶K与Triton X-100进行线粒体蛋白细胞亚定位分析

（图源：Zhou et al., STAR Protoc, 2023）