首个牧草（美洲狼尾草）图形泛基因组揭示耐热新机制

近年来，粮食安全问题越来越严重，随着全球变暖已严重影响作物产量，进而威胁世界粮食安全。据报道，全球平均温度每升高1°C，小麦产量将减少6%，水稻产量将减少3.2%，玉米产量将减少7.4%。因此，迫切需要解析植物的耐热机制，以开发能够耐受全球气温上升的作物，从而最大限度地提高农业产量，帮助满足不断增长的人口的粮食需求。另一方面近期在我国小麦主产区河南、山东、河北等地陆续出现割青麦作牛羊饲料的现象，引发社会强烈关注。由于事发正值四月底五月初，本是北方小麦进入灌浆期，再过一个月就会迎来丰收喜悦的时候，不少网友愤慨直言：农民卖没熟的麦子，是在毁粮。其主要问题之一就是牧草短缺。美洲狼尾草（Pennisetum glaucum [L.] R. Br., syn; Cenchrus americanus [L.] Morrone.），又名珍珠粟，是一种起源于非洲的多功能C4植物，为重要的饲用植物和杂粮类作物，具有优良的耐热性，是研究植物耐热机制的优良材料。

该研究构建了首个美洲狼尾草图形泛基因组，也是全球首个牧草领域图形泛基因组，将为牧草基因资源挖掘及育种提供重要资源。该研究还揭示了狼尾草耐热的分子机制，将为相关物种如玉米、小麦和水稻的耐热研究提供重要信息。该研究将在保障粮食安全、应对全球气候变暖等方面发挥重要作用。

1.美洲狼尾草基因组组装和泛基因组分析

该研究使用PacBio HiFi、BioNano、Hi-C和Illumina测序策略对从8个地区收集的394份美洲狼尾草核心种质中10份代表性材料进行染色体水平基因组组装（图1a - b ）。基因组大小在1.89 ~ 2.00 Gb之间，scaffold N50值在193.80 ~ 286.98 Mb之间，为k-mer分析（1.97 ~ 2.01 Gb）预估基因组大小的95.8% ~ 99.47%，与流式细胞分析预估的基因组大小基本一致。与之前公布的美洲狼尾草参考基因组相比，contig N50值增加了155 ~ 3,959倍。对新组装的10个基因组的质量进行评估，illumina高质量数据的比对率在95.62 ~ 99.57%之间，覆盖了94.92 ~ 99.90%的基因组。BUSCOs评估基因组完整度均大于91.60%，LAI值大于24，QV值大于40。以上指标说明组装的美洲狼尾草基因组具有良好准确性、完整性和连续性。每个基因组平均被预测了36,847个蛋白基因，转座元件（TE）的含量为70.44 ~ 72.62% 。将这10个新组装的基因组与之前发表的1个基因组进行泛基因组分析，共获得14,608个核心基因家族，约占总基因家族的一半（46.60 ~ 52.08%），可变基因家族（39.75 ~ 49.94 %）占比其次，特有基因家族所占比例最小（0.73 ~ 8.73%）（图1c）。通过将PI537069基因组与其余10个基因进行比对，共鉴定到744,364个SVs，包括622,584 PAVs , 2,177 倒位（INVs），91,852 拷贝数变异（CNVs）和27,751重排变异（TRANS）。

图1 美洲狼尾草高质量基因组组装和泛基因组分析

(图源：Yan H, et al., Nat Genet, 2023)

2. RWP-RK 转录因子家族的扩张有助于耐热性的形成

美洲狼尾草具有优良的耐热性（图3a）。为解析美洲狼尾草耐热性形成的分子机制，研究者通过对多个物种进行比较基因组学分析。结果发现，美洲狼尾草中扩张的、正选择的、物种特异性的基因家族以及长末端重复序列（LTRs）附近的基因均在胁迫相关的通路中显著富集。其中，响应生物或非生物胁迫的转录因子（TF）家族（ RWP-RK ）在美洲狼尾草中发生了扩张（图3b）。进一步研究表明，RWP - RK家族的扩张可能与早期LTR的扩张有关，并引起了美洲狼尾草中特异RWP–RKs基因数量的增加（图3c，d）。为探究RWP–RKs基因在植物响应高温胁迫中的功能，对高温处理后的叶片和根系进行了转录组测序分析，共鉴定到10个差异表达的RWP-RKs，包括2个特异性转录因子和8个非特异性转录因子。为进一步验证其功能，研究者在水稻中过表达RWP-RK （PMF0G00024.1）。结果发现，过表达该基因可显著增加转基因水稻的耐热性。同时，共调控网络分析和双荧光素酶验证分析结果均显示RWP-RK TF可调控转录激活两个胁迫相关基因PMA2G00541.1和PMA6G02031.1，进而参与植物耐热性调控。综上所述，RWP-RK TF基因家族的扩张对美洲狼尾草的耐热性具有重要的潜在贡献。

图2 RWP-RK基因家族的扩张有助于美洲狼尾草耐热性的形成

(图源：Yan H, et al., Nat Genet, 2023)

3.RWP - RK通过调控ER相关基因表达快速响应热胁迫

为了进一步解析美洲狼尾草耐热性形成的分子机制，研究对Tifleaf3基因型材料在8个高温处理时间点下的叶片和根系，对6个基因型材料在胁迫1 h和24 h的叶片分别进行转录组测序。对差异基因（DEGs）进行功能富集分析，结果显示DEGs主要富集于参与错误折叠蛋白修复和消除的ER相关通路中（图4a）。通过与发表的玉米和水稻的转录组数据进行联合分析，结果发现热胁迫处理下，美洲狼尾草中ER相关基因和热激蛋白（HSF）基因表达上调的比例高于玉米和水稻（图4b）。此外，研究还发现，RWP - RKs 与大部分ER相关基因（ 60.19 % ; 325 / 540）和HSFs（50.00 % ; 16 / 32）在热胁迫条件下表现出显著的相关性（Pearson 相关系数≥ 0.6, p 值 < 0.05），表明RWP – RKs可能与ER相关基因和HSFs共同作用以调控美洲狼尾草的耐热性。对这些基因上游潜在的RWP - RK结合位点进行预测分析，结果发现与玉米和水稻相比，美洲狼尾草中ER相关基因具有更高比例的结合位点。瞬时共表达RWP-RK转录因子和两个ER相关基因BiP（PMA2G00107.1）和OST（PMA4G03758.1），进一步证实RWP - RK可调控转录激活ER相关基因表达来发挥其功能（图4c）。以上结果表明，美洲狼尾草可能通过RWP - RKs在转录水平上调控HSFs和ER相关基因表达来快速响应热胁迫，以清除高温胁迫诱导产生的错误折叠蛋白（图4d）。

图3 美洲狼尾草通过内质网相关途径响应高温胁迫

(图源：Yan H, et al., Nat Genet, 2023)

4. SV对美洲狼尾草驯化过程中热胁迫适应性的贡献

前人研究提出SV能影响其附近基因的表达，为进一步探究SV与美洲狼尾草耐热性的关系，对SV附近热胁迫响应相关基因进行研究。结果发现，在所有材料中，位于SVs附近的基因对热胁迫反应更敏感（图5a，b），并利用烟草瞬时表达进行了验证（图5c-e）。为研究SVs对热胁迫调控基因表达的影响，选择4个耐热材料（HR）和2个热敏感材料（HS）进行分析，共筛选出44个候选SVs可能与34个热胁迫基因表达变化相关。根据RNA - seq数据，几乎所有这些基因（33 / 34）都响应热胁迫，其中11个基因（32.35 %）在ER相关的通路中富集，以上结果说明SVs在热胁迫调控中的潜在功能。研究进一步发现，在HR和HS组间存在差异的4个SV附近的HSP70同源基因（PMA1G04478.1和PMA7G02533.1）和HSC蛋白（PMA5G02838.1）均在HR与HS间存在表达差异（图5g）。综上所述，这些SVs可能通过影响热胁迫响应基因的表达参与调控美洲狼尾草的耐热性。此外，研究还鉴定到142个PAVs与一个或多个性状（共20个性状）关联。这些结果为美洲狼尾草的分子育种提供了新的见解，同样证明基于图形泛基因组找到的SV在美洲狼尾草耐热适应性和驯化过程中的重要作用。

图4 SVs对基因及美洲狼尾草耐热性的影响

(图源：Yan H, et al., Nat Genet, 2023)