1.苯丙氨酸解氨酶(PAL)
PAL是苯丙烷代谢途径的第一步反应酶,也是催化苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶。PAL最初从大麦中纯化获得,并初步证明其催化脱氨的生物学功能。目前,已克隆获得多种植物和一些原核微生物的PAL基因,其序列同源比对结果显示,原核生物与植物的PAL蛋白质序列相似性较低,说明其在进化上可能存在着不同的功能分化。通过对植物PAL蛋白结构的进一步解析,发现PAL催化位点包含1个特殊的脱氢丙氨酰基亲电中心。该基团与酪氨酸降解途径中的酪氨酸解氨酶(TAL)的催化活性中心具有十分相似的结构,并且将PAL催化活性位点上的保守氨基酸人为突变为TAL的保守氨基酸,突变后的PAL蛋白则具有了催化TAL特异性底物的能力。由于酪氨酸解氨酶在不同物种中分布较广,且在进化上相较于PAL更为古老,所以有学者认为PAL，可能是由TAL衍生进化而来。
在植物中,PAL主要表达于植物微管组织细胞以及表皮下细胞,参与细胞的木质化,其通常是由多基因编码的同源四聚体构成,在进化上相对保守。但是,PAL的拷贝数在不同植物的基因组中却各有不同。据报道,在模式植物拟南芥中有4个PAL蛋白，在欧芹和烟草中也均含有4个 PAL同源蛋白质,而在烟草中却至少含有40个PAL蛋白,在松树中目前则仅有1个PAL蛋白被报道。不同物种中PAL同源基因数目的巨大差异,说明不同物种间PAL的遗传多样性与其组织表达特异性和代谢调控的复杂性息息相关。例如，在拟南芥中,PAL1和 PAI2的表达模式基本相似,在植物根和茎的维管组织中具有较高表达。但PAL3在植物的整个生长发育过程中均呈现较低的表达水平,PAL4则主要在茎的生长后期具有较高表达量。同时,对拟南芥PAL基因的进化分析显示,4个PAL基因可分为2个亚族。其中, PAL1和PAL2属于1个亚族,PAL3和PAL4属于另一个亚族。再次说明PAL的遗传多样性使其在植物不同部位及不同生长时期发挥不同功能。对PAL的功能缺失突变体分析显示, pall pal2双突变体植株虽然可育,但由于PAL的缺失导致下游代谢受阻，使得种子颜色明显变黄。当进一步杂交获得pall pal2 pal3 pal4四重缺失突变体时,发现突变体花药发育受阻,最终导致植物育性显著降低,暗示着PAL基因虽然在不同的组织器官中具有不同的时空表达特性,但它们之间也存在一定功能冗余，共同调控下游代谢的稳态。
2.肉桂酸-4-羟化酶（C4H)
C4H是植物中第1个被克隆鉴定的一类细胞色素P450单加氧酶。同其他细胞色素P450酶一样,C4H可激活分子氧,最终将1个氧原子插入C-H键,同时将另1个氧原子还原成水。在植物苯丙烷代谢途径中,C4H 与PAL相互协同表达,负责催化肉桂酸C4位羟基化生成p-羟基肉桂酸,完成苯丙烷代谢的第二步反应。但在某些植物和某些种类的真菌和细菌中,特有的酪氨酸解氨酶能直接以酪氨酸作为底物催化生成p-羟基肉桂酸,而不需要C4H的催化。C4H蛋白的N-端富含脯氨酸,形成了具有膜锚定属性的疏水结构域，其C-端由半胱氨酸残基构成,位于胞内形成了与铁红素结合的结构域。蛋白质二级结构显示,C4H蛋白质富含大量α-螺旋,结构相对松散。其三级结构呈三角棱柱状,中心存在1个由α-螺旋包裹的血红素环,形成了与底物特异性结合的催化活性中心。
目前,已克隆获得多个物种的C4H ,例如高粱、向日葵和砀山酥梨等。研究发现,相比于PAL,C4H在植物的不同组织中均具有较高表达量,且同PAL类似, C4H的基因拷贝数在不同植物中也不尽相同,例如在豌豆和拟南芥中只有1个拷贝 ,首蓿中有2个C4H的基因拷贝，长春花的C4H则是由多个拷贝组成的同源基因簇推测不同物种中数目不等的C4H基因拷贝可能也与植物本身代谢调控的复杂程度相关。
3.香豆酸-CoA连接酶（4CL)
4CL为植物苯丙烷代谢途径中3个共有步骤中的最后1个催化酶,也是植物次生代谢中产生活化硫酯的主要支点酶。从功能上分析,4CL属于腺苷酸形成酶家族,催化甲氧基和羟基衍生物合成相应的辅酶A酯,随后被下游多种多样的加氧酶、还原酶和转移酶催化,生成木质素、黄酮、花青素、香豆素,角质和孢粉素等化合物,调控植物的生长发育及抗性响应。
对不同物种中4CL的氨基酸序列分析显示,其均具有2个相对保守的基序,Box I和 Box II。其中，Box I为一磷酸腺苷结合域,在所有腺苷酸形成酶蛋白家族中高度保守,负责催化底物的识别和结合。且在荧光素酶、乙酰辅酶A合成酶、长链脂肪酸辅酶A合成酶和肽合成酶中,均发现了与4CL中 Box I高度相似的基序。对拟南芥的4CL进行一系列的点突变,并通过分析这些突变蛋白质的催化活性和酶学特征,发现4CL与肽合成酶、荧光素酶、脂酰辅酶A合成酶等腺苷酸合成酶确实存在某些密切关系,提示4CL蛋白可能还有一些未知功能有待发掘。Box 同样在几乎所有的4CL中高度保守,中心的半胱氨酸残基被认为直接参与底物催化,其蛋白质活性可被硫基化学抑制剂有效抑制。对4CL底物催化活性及蛋白质晶体结构的分析显示,4CL特异的底物结合域,使得不同亚型的4CL可结合不同的底物。例如,拟南芥的4CL4蛋白,相比于其同源蛋白质特异性地缺失了338位保守的缬氨酸,导致其底物结合域的空间结构发生变化,而特异性结合并催化芥子酸。因此,在未来的研究中,特异性修饰或改变4CL蛋白底物结合域的氨基酸序列,将极大可能开发具有新底物催化活性的4CL蛋白,进一步拓展其营养和医药应用。
4.苯丙烷代谢途径其他催化酶
在大多数物种中,PAL、C4H 和4CL构成了苯丙烷代谢的共有途径。在这3种酶的依次催化下，将苯丙氨酸转化为辅酶A激活的羟基肉桂酰硫酯，使初级代谢的碳流发生质的改变。然后,再经过下游其他酶类的催化进入2个主要的下游途径,即单酚或黄酮类物质的生物合成。
羟基肉桂酰辅酶A(HCT)被认为是控制下游单酚类化合物代谢走向的关键因子,其属于BAHD类酰基转移酶的大家族,随后在肉桂酰辅酶A还原酶(CCR）和肉桂醇脱氢酶(CAD)的催化反应下生成木质素。研究显示，这些催化酶基因均为多基因构成的基因家族,且同源基因具有一定的组织表达特异性。所以,单基因的缺失突变对植物体内木质素的含量影响较小。查尔酮合酶(CHS）被认为是控制下游黄酮类化合物代谢走向的关键酶。其催化合成的查尔酮,经酮异构酶(CHI)作用生成黄烷酮柚皮素,然后再经一系列羟化酶作用,例如F3H、F3'H、F3'5'H等酶的催化,生成黄烷酮、圣草酚、二氢杨梅酮和二氢梅皮素等物质。但在茄科和茜草科植物中,因其拥有特殊的绿原酸代谢途径,又使得苯丙烷下游代谢途径略有不同。所以,目前对植物苯丙烷代谢途径的认知可能仍存在很多空白,大量的催化酶类及代谢底物和产物仍有待发现。
