无创性远程控制STING信号助力精准肿瘤免疫治疗

固有免疫反应是机体抵御外来病原微生物入侵的第一道防线，该过程主要由表达于机体固有免疫细胞中的一类能够直接识别病原相关模式分子（PAMP）的受体蛋白诱导发生。干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）是免疫系统检测病原体DNA的主要分子。STING通过识别胞质外来或者内源DNA，激活天然免疫和适应性免疫应答。研究显示，激活STING信号通路有利促进固有免疫细胞对肿瘤的免疫反应及杀伤作用，进而增效肿瘤免疫治疗。例如，树突状细胞（Dendritic cells，DC）中STING通路的激活会促进其成熟及抗原提呈，从而激活CD8⁺ T细胞对肿瘤的杀伤作用。因STING信号通路在抗肿瘤免疫中的巨大潜力，STING激动剂的开发已成为研发热点。然而，STING激动剂的临床应用面临诸多问题，如：1）STING蛋白在人体多数细胞中普遍表达，STING激动剂系统性给药可能造成全身的免疫反应及大量炎症因子分泌，损伤正常组织[1]；2）过度活化的STING通路会导致T细胞及B细胞的凋亡[1]；3）近期研究显示，STING信号的慢性活化会诱发肿瘤细胞的染色质不稳定，从而促进肿瘤转移[2]。因此，如何时空特异性地激活固有免疫细胞中的STING信号通路就成为了亟待解决的问题。

光遗传学（optogenetics）是联合光学及遗传学的新兴学科。将光敏感蛋白与效应蛋白连接，构建可受光调控的融合蛋白，将其表达于靶细胞后，可通过光来调控效应蛋白的功能，进而达到操控细胞功能的目的。借助光的特性，光遗传学技术对细胞的功能的调控具有秒级快速的响应性、精确的时空特异性的特点[3-6]。近期研究中，研究人员利用光遗传学工具精准调控CAR-T细胞激活，从而避免了细胞因子风暴及脱靶效应带来的副作用[6]。

该研究开发了名为LiSmore（light-inducible SMOC-like repeats）的光遗传学工具。表达LiSmore的DC细胞（LiSmore-DC）可在蓝光作用下时空特异性地激活STING信号通路，促进DC细胞的成熟及抗原提呈作用，进而激活CD8⁺T细胞的肿瘤杀伤作用。除此之外，LiSmore-DC与PD-L1单抗联合，可协同增效对单抗失效肿瘤的抑制作用。进一步研究显示，蓝光激活的LiSmore-DC具有杀伤远端肿瘤的效应（Abscopal effect)），可有效抑制非光照侧的黑色素瘤生长。综上，LiSmore的应用实现了对DC细胞STING通路的时空精准操控，从而实现了安全精准的细胞免疫疗法(图1)。

图1. 光遗传学工具LiSmore的应用可实现蓝光作用下时空特异性地激活STING信号通路，与STING小分子激动剂相比，LiSmore的应用避免了系统性给药带来的STING通路过度激活、泛细胞激活带来的副作用。

STING蛋白由跨膜结构域、二聚化结构域、环二核苷酸结合域, 以及C末端结构域组成。在静息状态下, STING C末端结构域（C terminal tail，CTT；aa 340-379）呈现出自抑制失活状态。2'3'-cGAMP与STING蛋白结合后可引起其蛋白构象改变，形成多聚体。与此同时，原本自抑制的CTT被暴露出来，STING CTT与TBK1（tank-binding kinase 1, TBK1）及IRF3（interferon regulatory factor 3, IRF3）相互作用，引起TBK1及IRF3的磷酸化。继而IRF3发生核转位，启动下游基因基因转录，激活STING信号通路。隐花色素2（Cryptochrome2，CRY2）是一种蓝光敏感蛋白，可在蓝光诱导下由单体变为多聚蛋白复合体。研究人员将CRY2蛋白与2段串联的STING CTT进行融合（命名为CRY2-pLxIs），研究结果显示，CRY2-pLxIs可在蓝光诱导多聚后招募TBK1及IRF3，激活IRF3的核转位，并上调STING通路下游基因的表达以及IFNβ的分泌。蓝光对组织的穿透性较差，这极大地限制了光遗传学工具的体内应用。为了应对这一问题，研究人员用CRY2_clust替代CRY2, 构建CRY2_clust-pLxIs。CRY2_clust是CRY2的突变体，其对蓝光极其敏感。与CRY2-pLxIS相比，CRY2_clust-pLxIs可在强度低至0.1mW/cm²的蓝光照射后发生多聚，激活STING信号通路(图2)。因其超灵敏的蓝光响应性，研究人员将CRY2_clust-pLxIs用于后续的实验，并将这一光遗传学工具其命名为LiSmore（light-inducible SMOC-like repeats）。

图2. LiSmore构建示意图及功能表征。（a）设计示意图；（b）CRY2-pLxIs在蓝光激活后发生多聚，招募TBK1-GFP, 并激活STING信号通路下游基因（c）；（d）与CRY2-pLxIS相比，LiSmore可被强度低至0.1mW/cm²的蓝光激活，促进IFNβ的生成释放。

研究发现，将LiSmore转导至DC细胞后，DC细胞可在蓝光照射下特异性激活STING信号通路，上调CD80，CD86，CCR7等激活标志物的表达，促进DC的成熟及抗原提呈作用。体外共培养模型显示，蓝光照射后，LiSmore-DC可激活OT-1 T细胞的活化与增殖，促进其IFNγ的释放，并增强OT-1 T细胞对B16-OVA细胞的杀伤作用(图3)。

图3. （a）LiSmore转导至DC细胞后，DC细胞可在蓝光照射下特异性激活STING信号通路，上调CD80，CD86，CCR7等激活标志物的表达，促进DC的成熟及抗原提呈作用（b）；（c）体外共培养模型显示，蓝光照射后，LiSmore-DC可激活OT-1 T细胞的活化与增殖，促进其IFNγ的释放，并增强OT-1 T细胞对B16-OVA细胞的杀伤作用。

研究人员随后构建B16-OVA的荷瘤小鼠模型，在成瘤后将LiSmore-DC及OT-1 T细胞转输至荷瘤小鼠体内，并在随后的5天内使用蓝光LED对小鼠进行照射。研究发现，蓝光可特异性激活转输至体内的LiSmore-DC，促进其抗原提呈作用。激活的LiSmore-DC促进了OT-1 T细胞的增殖与IFNγ的分泌，从而有效的抑制了B16-OVA肿瘤的生长(图4)。

图4. （a）蓝光LED照射荷瘤小鼠;（b）实验设计图;（c,d）蓝光可特异性激活转输至体内的LiSmore-DC，促进其抗原提呈作用，有效的抑制了B16-OVA肿瘤的生长。

LL/2肺癌细胞是一种的具有强烈免疫抑制性的“冷”肿瘤，免疫检查点抑制剂如PD-L1单抗对其治疗效果不佳。研究人员将LiSmore-DC及OT-1 T细胞转输至LL/2荷瘤小鼠体内，研究发现，蓝光激活LiSmore-DC后，可有效的抑制LL/2-OVA肿瘤生长。除此之外，联用PD-L1单抗及蓝光激活LiSmore-DC可进一步的抑制LL/2肿瘤生长。进一步研究表明，蓝光激活的LiSmore-DC具有杀伤远端肿瘤的效应（Abscopal effect）。研究人员使用B16F10分别在C57B6小鼠双侧背部成瘤。在转输LiSmore-DC的小鼠中，仅用蓝光照射右侧背部，而左侧远端肿瘤部位予避光处理。类似的，在对照组中仅在小鼠右侧瘤内注射PBS或STING激动剂2’3’ cGAMP。结果显示，蓝光激活的LiSmore-DC可有效抑制光照侧（近端）及非光照侧（远端）的肿瘤生长，而STING激动剂2’3’ cGAMP仅能抑制注射区肿瘤的生长，对远端肿瘤无明显抑制作用(图5)。

图5. （a,b）蓝光激活LiSmore-DC后，可有效的抑制LL/2-OVA肿瘤生长。PD-L1单抗及蓝光激活LiSmore-DC联合可进一步的抑制LL/2肿瘤生长。（c）蓝光激活的LiSmore-DC可有效抑制光照侧（近端）及非光照侧（远端）的肿瘤生长，而STING激动剂2’3’ cGAMP仅能抑制注射区肿瘤的生长，对远端肿瘤无明显抑制作用。

文章结论与讨论，启发与展望

综上，小分子激动剂相比，LiSmore的应用避免了系统性给药带来的STING通路过度激活、泛细胞激活带来的副作用, 为精准激活STING信号通路提供了新的无创性远程控制方法。