首次在分子水平对卡马西平的Read-across假设进行直接验证

人用药物作为新兴环境污染物，其潜在环境风险一直是关注的热点。2013年，Science关于改变人类情绪的药物也会改变鱼的行为的研究报告引起了学术界和社会各界的广泛关注[1]。Read-across假设约定，若分子靶标保守，人用药物在非靶向生物血浆中的浓度与人体治疗血浆浓度（human therapeutic plasma concentration，H_TPC）接近时，药物将会对非靶向生物产生类似人的药理学效应[2，3]。若不同种类人用药物的Read-across假设成立，将利于直接从药物研发获得的药理学/毒理学数据预测药物对非靶向生物的环境效应和风险。药物的生物效应从人到鱼“reading across”的关键是获得鱼血浆浓度（fish plasma concentration，FPC）。鱼血模型为FPC的预测提供了有利工具[4，5]，然而该模型对药物的适用性还待探究。另外，现有read-across研究关注宏观生物效应指标（如行为）居多[1，3]，缺乏基于作用模式（mode of action，MOA）的分子水平的生物效应研究，从而无法直接证实类似人的作用模式。因此，亟需结合人用药物的实测FPC和基于MOA的分子水平生物效应对read-across假设进行直接验证。环境相关卡马西平暴露浓度下，鱼血模型低估了斑马鱼血浆中卡马西平的富集浓度。当实测鱼血浆浓度（FPC）在H_TPC/1000 ~ H_TPC范围内，卡马西平显著增加Glu和GABA，抑制ACh和AChE，抑制gabra1、grin1b、grin2b、gad1b和abat的转录，对鱼表现出了类似人的作用模式。该研究首次以内暴露浓度为剂量，以基于MOA的分子效应为指示终点，对卡马西平的Read-across进行了直接验证，为药物的环境风险评价提供了理论依据和技术支持。

图1. 文章总结图：当卡马西平的鱼血浆浓度（FPC）超过H_TPC/1000时，卡马西平对斑马鱼可产生类似人的药理学效应

卡马西平被广泛用于治疗精神运动性癫痫和双相情感障碍[6]，它可以调节神经递质释放、摄取和与受体的结合，并作为人γ-氨基丁酸受体的激动剂[7]。其具有清晰明确的作用模式，是研究read-across假设和鱼血模型的合适模型化合物。因此，本研究通过测定卡马西平的FPC，探究了鱼血模型对卡马西平的适用性，并结合实测FPC和基于MOA的分子水平生物效应对read-across假设进行直接验证。

为研究鱼血模型对卡马西平的适用性，将预测和实测的鱼血浆浓度进行了比较。环境暴露浓度下（1、10、100 μg/L），预测值均显著低于实测值，高浓度暴露组（1000 μg/L）则相反（图2）。实测值在预测值的10倍范围内。此外，效应比（effect ratio， ER）值越低，出现药理效应的概率越高。在本研究中， ER < 1000，表明暴露于卡马西平的斑马鱼可能会出现与治疗活性相关的药理学效应。

图2. 预测和实测卡马西平鱼血浆浓度（FPC）的关系。（A）预测FPC与实测FPC的关系。（B）log预测FPC与log实测FPC的关系。H_TPC：人体治疗血浆浓度。

卡马西平可调节神经递质的释放、摄取和与受体的结合，也可作为人γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）受体的激动剂[7]。本研究以鱼血浆浓度作为内暴露浓度，选择神经递质、酶和相关基因表达作为毒性终点，直接验证卡马西平的read-across假设。随着卡马西平暴露浓度的增加，斑马鱼体内乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）和乙酰胆碱酶（acetylcholinesterase，AChE）的水平逐渐低于对照组（p < 0.01）。如图3B和3C所示，与对照组相比，暴露于卡马西平7天后，谷氨酸（glutamic acid，Glu）和γ-氨基丁酸水平明显升高（p < 0.05）。鱼类的γ-氨基丁酸受体基因家族与哺乳动物相似[8]，这表明卡马西平可能在鱼类中产生类人的药理学效应。当卡马西平的鱼血浆浓度（FPC）接近或高于H_TPC/1000（4 ~ 12 μg/L，1000为安全系数，考虑了人到动物的差异10倍，物种敏感性差异10倍，哺乳动物到非哺乳动物的差异10倍）时，与神经信号相关的以上4个指标呈现剂量依赖性。这表明斑马鱼在不同浓度的卡马西平暴露下确实表现出基于MOA的相关药理学效应。

图3.卡马西平对斑马鱼的神经递质（A-C）和乙酰胆碱酯酶活性（D）的影响。EC：外暴露浓度；FPC：鱼血浆浓度。

神经递质相关基因abat和gad1b参与调节谷氨酸- γ-氨基丁酸代谢途径。Gabra1和gad1b也与谷氨酸代谢有关。Grin1b和grin2b可以编码神经递质受体。与对照组相比，暴露于不同浓度的卡马西平后，abat、gabra1、gad1b、grin1b和grin2b基因的相对表达量均下调。当卡马西平的FPC接近或高于H_TPC/1000时， gabra1和grin2b的表达均较对照组显著降低，并呈现先升高后降低的趋势（图4）。这证明了卡马西平对斑马鱼具有类似人的作用模式，并且卡马西平的Read-across假说在分子水平上直接成立。

图4. 卡马西平对神经递质相关基因（A-E）表达的影响。EC：外暴露浓度；FPC：鱼血浆浓度。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究将与神经相关的暴露终点和内暴露浓度相结合，对read-across假设进行了验证。在环境浓度下，鱼血模型低估了血浆中卡马西平的富集浓度。当卡马西平的FPC超过相应的等效H_TPC（H_TPC/1000）时，其对斑马鱼可产生与人类似的生物效应，即基于MOA的神经系统的效应。这些发现证明了结合FPC和基于MOA的神经系统相关终点在解读和评估抗癫痫药物的环境风险中的益处。最后，建议对更多不同的药物和鱼种进行相关研究，进一步选择更合适的MOA指示终点，并在未来基于转录组学筛选出更多的相关基因。