自然杀伤（NK）细胞作为新兴的癌症免疫疗法正在受到越来越多的关注，如何能够稳定地、高质量地、大规模地获得NK细胞成为癌症研究和产业化领域的一大热点。以诱导多能干细胞（iPSC）和造血干细胞（HSC）为起始原料定向诱导分化NK细胞的方法有望补充现有的NK细胞的获取方式，同时利用iPSC和HSC的可编辑属性通过加入嵌合型抗原受体（CAR），为治疗恶性肿瘤带来了巨大的希望[1, 2]。目前，研究人员已经开发了多种运用iPSC和HSC体外再生NK细胞的方法，然而这些诱导分化方法中，普遍使用了人AB血清（ABS）或者胎牛血清（FBS）作为培养基的添加剂[3]。而ABS和FBS具有成份复杂且稳定性较差的缺陷，尤其是FBS具有动物源成分，不能很好满足临床级别的细胞生产。因此亟需开发一种无血清替代物来满足临床级生产和应用需求，同时保障其高性能和高产能。该研究首次使用人血小板裂解物（hPL）代替ABS作为添加剂诱导人HSC体外定向分化为NK细胞。该研究为NK细胞治疗领域提供了一种无血清的分化体系，具有重要的转化意义。
由于血小板颗粒中储存着丰富的细胞因子和生长因子，通过各种释放策略制备的hPL已被确定为FBS的合适替代品，可作为培养基添加剂，能够在无血清条件下高效繁殖人类细胞[4, 5]。近年来，有报道显示hPL可以用于间充质干细胞（MSC）和NK细胞的体外扩增[5, 6]。但hPL还未被应用于iPSC或HSC体外定向诱导分化成NK细胞的过程中。
在本研究中，作者围绕HSC定向诱导分化成NK细胞过程设计实验，分别使用hPL或ABS作为添加剂进行NK细胞的诱导分化，并比较分化过程中细胞形态、增殖情况、活率以及典型表面标志物表达情况的差异。同时，通过体外杀伤实验，比较了两种添加剂来源的NK细胞对常见肿瘤细胞K562、HepG2和A549的杀伤效果的差异。作者通过全转录组测序分别对外周血分离NK细胞（PB-NK），hPL诱导分化而来的NK细胞（hPL-NK），ABS诱导分化而来的NK细胞（ABS-NK）进行基因表达谱差异的分析。
从结果来看，作者通过对分化过程中的细胞进行分析发现hPL组和ABS组均可产生表型成熟的NK细胞。同时作者在分化周期的不同时间点分别对两组细胞进行细胞数量和活率的监测，结果显示在第17天（D17）之前两组添加剂在细胞增殖方面没有显著差别，而在D17后，hPL相较于ABS , 前者显著促进了细胞增殖。然而，分化过程中两组细胞在细胞活率上没有显著差异。
接下来作者在分化过程中不同时间点（D10，14，17，20）对CD3-CD56+细胞群比率进行检测，发现ABS组和hPL组中CD3-CD56+细胞群比率都随着分化过程持续升高，两组之间并没有明显差异。然而作者对分化终末阶段的NK细胞表面抗原标志物进行检测，发现hPL组相较于ABS组产生了更多的CD56+CD16+的NK细胞，同时多分化出一群更为成熟的CD56dimCD16+的NK细胞。该结果表明hPL相较于ABS可以显著促进NK细胞的成熟。同时作者发现hPL组的CD335+CD56+NK细胞比率显著高于ABS组，而CD336+CD56+NK细胞比率显著低于ABS组（图1）。
图1 hPL作为添加剂对NK细胞相关表面抗原表达的影响
（图源：Naaijkens, et al., Cell and tissue research vol. 2023）
为了进一步分析hPL和ABS在诱导NK细胞中的差异，作者使用一种血液瘤细胞系（K562）和两种实体瘤细胞系（HepG2，A549）对两组NK细胞杀伤能力进行评估。结果显示，hPL-NK和ABS-NK对于K562和HepG2两种细胞系的杀伤能力类似。而hPL-NK对于A549的杀伤能力显著强于ABS-NK（图2）。
图2 hPL作为添加剂对NK细胞杀伤功能影响
（图源：Naaijkens, et al., Cell and tissue research vol. 2023）
为了探究hPL促进NK细胞分化的潜在分子机制，作者分别对PB-NK，hPL-NK和ABS-NK进行全转录组测序。基因表达热图和主成分分析（PCA）表明hPL-NK和ABS-NK总体上具有更为相似的基因表达谱，表现为ABS-NK及hPL-NK在PC1（主成分1）维度更为接近，而在PC2（主成分2）维度，hPL-NK与PB-NK更为接近。该结果表明hPL-NK的部分基因的表达水平更接近于PB-NK。作者分别构建PB-NK与ABS-NK以及hPL-NK与ABS-NK差异基因的火山图，结果表明与NK细胞功能性相关的蛋白如CD16，CD86，CD74，CD79b，TBX21，CD247，IL21R等在hPL-NK和PB-NK中的表达显著高于ABS-NK。接下来作者对PB-NK和hPL-NK相对于ABS-NK上调和下调的基因构建韦恩图分析，并将重叠部分进行Gene Ontology（GO）富集，并筛选最为显著的20条通路进行分析。结果显示，PB-NK和hPL-NK相较于ABS-NK上调的基因而言，主要富集于免疫应答、细胞激活以及免疫细胞介导的细胞毒性等通路；而PB-NK和hPL-NK相较于ABS-NK下调的基因主要富集于细胞连接、酶联受体蛋白信号通路、趋化性等通路。该结果表明hPL-NK和PB-NK相较于ABS-NK，一些免疫相关的通路被激活。这些通路的激活可能与NK细胞的功能相关。为了进一步验证hPL对NK细胞分化的影响，作者分析了NK细胞激活受体、抑制受体、NK细胞发育和成熟以及细胞毒性等功能相关的基因表达差异。热图显示，hPL-NK与PB-NK在相关基因表达上更为接近，特别是NK细胞发育与成熟以及NK细胞介导细胞毒性相关基因的表达。以上结果表明hPL在促进NK细胞成熟和细胞毒性方面优于ABS。
