微生物测序RDA冗余分析

对于微生物测序数据，除了通过差异统计分析来筛选各组样本中的微生物标志物种或基因的信息外，我们还需要将其它各种检测手段获得的数据，比如理化性质测定得到的各类数据，与微生物测序的数据进行关联分析，以期找出与各类指标变化相关联的具体微生物物种及其基因。

在微生物多样性分析中，排序分析的过程就是在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本，使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息，使得排序轴能够反映一定的生态梯度。排序分析包括只使用物种组成数据的排序称作非限制性排序，如主成分分析(PCA)、对应分析(CA)、去趋势对应分析(DCA)、主坐标分析(PCoA)、非度量多维尺度分析(NMDS)等；同时使用物种和环境因子组成数据的排序叫作限制性排序，如冗余分析(RDA)、典范对应分析(CCA)等。

RDA是响应变量矩阵与解释变量之间多元多重线性回归的拟合值矩阵的PCA分析，RDA分析可以将样本和环境因子反映在同一个二维排序图上，从图中可以直观地看出样本分布和环境因子间的关系。环境因子一般用箭头表示，箭头所处的象限表示环境因子与排序轴间的正负相关性，箭头与原点的连线长度代表着某个环境因子与群落分布和种类分布间相关程度的大小，连线越长，说有相关性越大，反之越小。箭头连线和排序轴的夹角代表着某个环境因子与排序轴(RDA1和RDA2，主成分1、2)的相关性大小，夹角越小，相关性越高；反之越低。

（1）在这个图中，箭头表示环境因子，每个点代表一个样本，不同颜色的点属于不同分组。

（2）箭头连线的长度表示该环境因子与样本分布间相关程度的大小，连线越长，相关性越大，反之越小。

（3）箭头连线和排序轴的夹角以及箭头连线之间的夹角表示相关性，锐角表示成正相关关系，钝角则表示成反相关关系。夹角越小，相关性越高。

（4）箭头所指方向表示群落分析指标或环境因子的变化趋势。

（5）坐标轴括号中的百分比代表了对应的坐标轴所能解释的原始数据中差异的比例。

那怎么看某个环境因子对所有样本的影响呢？

样本在蓝色箭头上投影点的位置，近似代表该因素在对应样本中的数值大小。在上图中，将变量射线延长，样本垂直投影于射线上，沿着变量箭头方向，环境变量值增大。图中样本Sa3和Sa4所对应的环境变量A值近似相等，A对所有样本影响的大小排序为：Sa1>Sa4≈Sa3>Sa2>Sa5。

下面以两个实际案例进行说明：

例如，上图以土壤有机质(SOM)、土壤pH、硝态氮(NO3 --N)和铵态氮(NH4 +-N)含量与根际细菌群落的变化之间进行了冗余分析。结果表明,群落结构差异在两个排序轴上的解释率分别为22.75%、5.49%,与 NO3 --N 正相关,而和 SOM、NH4 +-N 及 pH 无显著相关关系;同时从图中可以看出,NO3 --N 指向了 N375 处理的细菌群落,这可能是由于土壤在施入过量氮肥之后,通过提高土壤的 NO3 --N 含量从而导致微生物群落结构的变化,通过显著性检验分析,结果显示 NO3 --N 是影响根际细菌群落结构变化的主要因子 (F=3.7001,P=0.001*** )。

例如，上图选择排序前十的优势细菌纲与环境因子进行冗余分析，以便更好地寻找细菌与环境因子的相关性。结果表明细菌群落受土壤理化因子影响的程度不同，筛选出影响细菌群落的 6 个主要环境因子（土壤有机质、全磷、全钾、速效氮、pH 和含水量）对群落物种分布的影响具有显著性（P=0. 004），6 个主要土壤环境因子对物种分布的累计解释率为 96. 59%，其中 RDA 前两个排序轴的特征值分别解释了 62. 21% 和 19. 69% 的细菌群落变化。土壤全磷、速效氮、有机质与第一排序轴正相关，pH、含水量、全钾与第一排序轴负相关。土壤全磷、速效氮、有机质是贡献率较大的环境因子，各处理土壤细菌群落主要受到该 3 个土壤因子的影响。土壤理化因子对优势细菌群落的影响主要表现在放线菌纲（Actinobacteria）、酸微菌纲（Acidimicrobiia）与土壤 pH 呈显著正相关，与全磷、速效氮、有机质含量、含水量呈显著负相关；变形菌纲中α 变形菌纲（Alphaproteobacteria）与土壤有机质呈显著正相关，与含水量、全钾呈显著负相关；δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）与含水量、全钾呈显著正相关，与有机质呈显著负相关；γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）与有机质、速效氮、全磷呈显著正相关，与 pH、全钾呈显著负相关。