抗生素在畜禽养殖业的大量使用造成抗生素抗性基因（ARGs）污染日益严重。只有少量抗生素参与动物的新陈代谢而被有效利用，大部分抗生素及其在动物体内诱导出的抗生素抗性基因（ARGs）随着动物尿液和粪便直接排出体外，这些不经任何处理并残留有抗生素的粪便作为有机肥施入农田，将会对土壤环境中微生物的耐药性产生压力，再次诱导出抗生素抗性基因，造成严重的环境污染和生态毒性。堆肥作为一种将粪便资源化的优良传统方法，能否有效去除畜禽粪便中的ARGs而防止环境污染值得探讨。
一、ARGs的传播和扩散
兽用抗生素在畜禽养殖业中的长期滥用，在养殖动物肠道内诱导出抗性菌株，畜禽粪便中这些含有ARGs的抗性菌株是土壤和地下水中ARGs的最重要来源之一，大量畜禽粪便的排放会直接导致 ARGs的面源污染。
动物粪肥对土壤中的抗性细菌具有选择性压力，畜禽粪便施肥是耐药微生物及ARGs进入土壤环境的主要途径。进一步的研究发现ARGs不仅能在动物肠道的菌株间传播，还能整合到一些可移动基因元件上（如质粒、转座子、整合子等），进入土壤环境后还能够在土壤土著细菌与其他微生物之间传播扩散。在选择性压力条件下，携带有ARGs的病原微生物通过基因水平转移作用在各种土著微生物之间进行传播。通过这种基因横向转移，ARGs可以在土壤、地下水等环境介质中迁移、转化，并且这种获得 ARGs的土著微生物由于适应性强，很容易大量繁殖成为抗性基因的储存库。更重要的是，食用产品中的 ARGs 和土壤中的抗性质粒极有可能伴随食物链进入人体，增加人体的抗生素耐药性。由于基因污染特殊，具有遗传性，很难控制和消除，一旦传播开来将对人类健康和生态系统造成长期、不可逆的危害。因此，应当严格重视畜禽粪便中ARGs 进入环境中造成的环境污染问题和进入人体造成的潜在威胁。
二、畜禽粪便堆肥对ARGs污染水平的影响
堆肥是处理各种废弃物使之无害化和资源化的一种有效途径，利用堆肥去除畜禽粪便中有害污染物也能起到一定的效果。基因是具有遗传效应的 DNA片段，抗性基因的直接载体是微生物，堆肥中微生物群落结构属于动态变化的过程，优势菌群会逐渐取代弱势菌群占据支配地位。堆肥过程中微生物群落结构发生变化，携带有ARGs的菌群也会随之变化。抗性基因在传播过程中虽然可以通过基因水平转移来传播扩散，但得到载体的基因原件，如抗性质粒不能承受很高的温度，故在堆肥高温阶段可以有效去除。研究发现在猪粪堆肥高温阶段主要携带抗性基因的大肠杆菌不能承受高温而死亡，随后微生物群落会有短暂的恢复，在起始阶段的 0、1、3、7 d 微生物多样性有一定区别，但总体上堆肥前后微生物多样性增强，加入额外抗生素在一定程度上影响优势菌群的变化，而且堆肥过后抗性基因的绝对丰度变低。为了在堆肥过程中有效地降低 ARGs 的丰度，需要重点研究堆肥过程中抗性微生物的变化和影响微生物群落结构变化的因素。
三、堆肥抗生素抗性基因的检测
1、检测原理
使用实时定量分析仪（qPCR）对堆肥过程中抗生素抗性基因检测，根据不同抗生素抗性基因类型，使用不同引物对其进行扩增，获取其DNA片段，再与标记有荧光素的Taqman探针进行混合，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律。与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，抗性基因在特定光激发下发出荧光。经堆肥处理后的抗性基因含量与未经堆肥处理的抗性基因进行比较，以抗性基因拷贝数为最终检测指标。
2、样品前处理
针对于不同规模堆肥厂中堆肥初期及堆肥腐熟后产品中抗生素抗性基因进行检测。针对不同堆体规模规格的畜禽粪便废弃物堆肥，按照四等分法进行堆肥样品采集。取样后应立即置于液氮或低温取样盒中，及时进行抗生素抗性基因检测。若不能及时检测，应将堆肥样品于-20℃保存直至分析。在取样过程中所有使用的工具在每次使用后都需高压灭菌或用75%的乙醇清洗。
3、实验步骤
（1）样品总 DNA 提取
a)取 3g 堆肥样品置于 50mL 离心管中，向其中加入 10mL 脱腐缓冲液、10mLPBS 缓冲液；
b) 涡旋混匀后 1000rpm 离心 10min；
c)缓慢将上清液转移到新的 50mL 离心管中，向原离心管中再次加入 10 mL 脱腐缓冲液、10 mLPBS 缓冲液；
d) 涡旋混匀后再次 1000rpm 离心 10min；
e) 将两次获得的上清液合并。将合并后的上清液 10000rpm 离心 5min，弃上清，得到脱腐后的堆肥样品；
f)采用土壤 DNA 提取试剂盒对经脱腐后的堆肥样品进行 DNA 提取；
g) 用 1%琼脂糖凝胶电泳对 DNA 提取效果进行检测，运用分光光度计对 DNA 的OD260 和OD280 进行测定，OD260/OD280 比值应在 1.6～1.8；
h) 将提取的 DNA 储存于-20ºC 冰箱中。
（2）抗性基因标准曲线绘制
a) 获取目的基因片段：用ARGs引物对目的基因片段进行 PCR 扩增，模板为堆肥样品的总 DNA，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行验证；
b) 将 PCR 产物进行胶回收纯化；
c) 将胶回收产物连接到 PMD18-T 载体上，将连接产物转入 E.coli DH5α感受态细胞；
d) 蓝白斑筛选阳性克隆子并分离纯化，进行测序验证；
e) 从阳性克隆子中提取重组质粒，再次对重组质粒进行 PCR 验证；
f) 计算质粒拷贝数（copies），质粒拷贝数/μL DNA=(c×6.02×1014)/(L×660)，其中，c 为重组质粒的浓度，L 为重组质粒的大小（pMD18-T 载体大小+目的基因片段大小，bp）；
g) 质粒梯度稀释：根据以上计算的拷贝数，将质粒依次进行 10 倍梯度稀释，最终稀释为 7 个浓度梯度，稀释剂为超纯水（DEPC）；
h) 绘制标准曲线：以稀释好的质粒为 DNA 模板，进行荧光定量 PCR 扩增，查看扩增曲线和融解曲线确认扩增效果良好。以 CT 值为横坐标，log（copies）为纵坐标，建立一元线性方程。
（3）抗性基因荧光定量PCR
按照100个20μL反应体系所需试剂配制无DNA模板的反应混合液，混匀后在0.1mL96 孔板的每个孔中分装18μL混合液（2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10µl；Primer1(10µM) 4µl；Primer2 (10µM) 4µl），然后加2μL DNA模板，阴性对照加入2μL DEPC水代替DNA模板，每个样品设置三个重复。
反应程序为：
a) 预变性：95ºC 保持 30s；
b) 40 个循环扩增：95ºC 保持 10s，退火 30s；
c) 溶解曲线检测：95ºC 保持 15s，60ºC 保持 60s，95ºC 保持 15s；
d) 根据反应 CT 值带入标准曲线计算出未知样品中目的基因的浓度（copies/μL DNA）。
