类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）以多关节炎症为主要病理表现，如果不进行适当的治疗往往会造成不可逆的关节结构损伤[1]。RA的全球发病率约为0.5%-1% [2-4]，它会影响患者的身体功能，并给个人和社会带来巨大的负担[2, 5, 6]。及时且精准的治疗，从而迅速控制病情是RA治疗的关键。RA作为一种慢性骨关节炎症疾病，患者需要进行长时间的抗关节炎治疗，这也诱发了另一个问题的产生--RA耐药性，该问题往往导致药物治疗的失败。因此，要保证治疗的有效性就要深入探究RA耐药机制，进而解决耐药问题。该工作以在RA患者中检测到的p53突变点为研究对象，类风湿性关节炎患者成纤维样滑膜细胞（RAFLS）为研究载体。通过p53突变过表达RAFLS细胞模型的甲氨蝶呤细胞毒性，抗凋亡能力及迁移能力综合评估p53突变介导甲氨蝶呤耐药程度，由此建立了一个以p53突变为基础的甲氨蝶呤耐药平台及药物筛选平台，阐明了p53突变介导的甲氨蝶呤耐药反应的潜在机制。

 

 

该研究绘制了RA患者中p53基因的突变图谱（图1a），并且利用定点突变分子克隆技术建立了首個RA患者的p53突变体质粒文库。

 

一、MTX 治疗 RA 是否会因 p53 基因突变而减低药效？

研究者用过表达所有 RA 相关 p53突变体的质粒转染 RAFLS，并测量细胞对MTX的存活率以评估 MTX 的细胞毒性。数据显示大部份过表达 p53突变体的 RAFLS 产生了增加的 MTX 抗性表型（图 1b），MTT法最大的 MTX 耐药倍数为4.83倍，蓝色代表转染RAFLS MTX耐药倍数>4.83的p53突变体，灰色代表转染RAFLS MTX耐药倍数<4.83的p53突变体。表明某些 p53基因突变可能影响 RA 患者 MTX 治疗的药物疗效。

 

图1 RA患者p53突变的热点图及转染了p53突变基因的RAFLS中MTX的MTT测定

（图源：Qiu C. et al., Genes & Diseases, 2023）

 

二、具有 MTX 抗性表型的 p53 突变体是否会驱动 RAFLS 中的细胞凋亡抗性表型？

研究者通过两个方面评估具有 MTX 抗性表型的 p53 突变体是否引起抗凋亡反应。

 

1. RT-PCR检测p53突变体过表达 RAFLS 中细胞凋亡标志物的表达

细胞凋亡标志物包括抗细胞凋亡的Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1（Bcl-2 associated athanogene 1，BAG1）、细胞FLICE样抑制蛋白(cellular FLICE-Like inhibitory protein, cFLIP)、肿瘤坏死因子受体相关因子2（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）和X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP），以及促凋亡的凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)、与Bcl-2相互作用的细胞死亡介质(Bcl-2-interacting mediator of cell death, BIM)、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）和Bcl-2同源拮抗剂杀手蛋白（Bcl-2 homologous antagonist killer，Bak）。结果显示，部分 p53 基因突变导致抗凋亡蛋白的上调和促凋亡蛋白的下调，表明RAFLS细胞凋亡抗性表型（由至少三个受影响的凋亡标记定义）的发展是由这些突变驱动的。值得注意的是，在所有这些具有 MTX 抗性表型的突变中，R213* 和 R248Q 同时上调了抗凋亡蛋白并下调了促凋亡蛋白（图2）。

 

图2 实时荧光定量PCR分析转染RAFLS的p53突变体中凋亡相关标志物的表达水平

（图源：Qiu C. et al., Genes & Diseases, 2023）

 

2. 流式检测p53突变体过表达 RAFLS的凋亡细胞比例及caspase-3活性

为了进一步分析因过表达p53突变基因而具有极高MTX IC₅₀（>100μM）的RAFLS是否表现出抗凋亡表型，作者分析了凋亡标记物膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI-PE）和 caspase-3 活性。结果表明，同樣在MTX的處理下, 与 p53 WT (正常基因) 相比，某些p53突变体具有较低的细胞凋亡百分比和caspase-3 凋亡活性（图3）。

 

图3 通过膜联蛋白V-FITC/PI-PE染色和caspase-3凋亡活性测定法检测RAFLS在MTX处理下转染了p53突变体的抗凋亡表型。

（图源：Qiu C. et al., Genes & Diseases, 2023）

 

三、RA 相关的 p53 基因突变是否会促进 RAFLS 的细胞迁移？

越来越多的证据表明，赋予功能获得活性的 p53突变会促进细胞迁移。研究者通过两个方面评估具有MTX 抗性表型的 p53突变体是否引起促迁移反应。

 

1.RT-PCR检测p53突变体过表达 RAFLS 中细胞迁移标志物的表达

在癌症患者中p53突变体往往伴随着癌细胞迁移能力的增强，基于此作者检测了p53突变体过表达RAFLS中细胞迁移相关基因的表达情况，包括肌动蛋白相关蛋白2（Actin Related Protein 2，ACTR2）、细胞分裂周期蛋白42（Cell division cycle 42，CDC42）、丝切蛋白1（Cofilin-1，CFL1）、集落刺激因子1(Colony stimulating factor 1，CSF1), 皮层肌动蛋白(Cortactin，CTTN), 基质金属蛋白酶2 (Matrix metallopeptidase 2，MMP2), 膜突蛋白(Moesin，MSN)和BCAR1支架蛋白-Cas家族成员(BCAR1 scaffold protein-Cas family member，BCAR1)。

 

2.细胞划痕和transwell迁移分析来进行评估。

结果显示, 两个 p53突变体H193Y 和 R248Q，可能通过促-迁移蛋白的上调（大于 2 倍的增加）和抗-迁移蛋白的下调（减少0.5 倍），推动 RAFLS 迁移表型的发展(图4a)。此外，伤口愈合（图4b，图片表示转染RAFLS的p53突变体在24小时和48小时内的迁移活动）和transwell迁移测定结果表明（图4c，图片显示RAFLS在48h后的迁移情况），多个p53突变体能够在24小时或48小时內促进RAFLS的迁移、侵袭表型。

 

图4 实时PCR分析p53突变体转染RAFLS中迁移相关标记的表达水平,Wound Healing及transwell测定p53突变对RAFLS迁移能力的促进作用

（图源：Qiu C. et al., Genes & Diseases, 2023）

 

文章结论与讨论，启发与展望

一些 p53 突变体获得了新功能，称为功能获得（GOF），例如化学抗性[7].研究证明了 p53 基因内的不同突变位点显示出不同程度的抗细胞凋亡和促迁移作用。其中，在DNA 结合域中的那些突变显示出相对较高的抗细胞凋亡活性。例如，R248Q 不仅抑制细胞凋亡和促进细胞迁移，而且诱导抗风湿药耐药，这可能涉及抗风湿药耐药性的发展。实际上，持续暴露于 MTX 的 RA 患者 p53 突变率相对较高 (~75%)，这表明 p53 突变可能由抗风湿药的长期治疗诱导。此外，72.6% 的 p53突变体可能导致 RAFLS 中的 MTX 抗性，提示p53是 MTX 诱导细胞凋亡的关键调节蛋白，而p53 基因突变可能通过抑制 RAFLS 中的细胞凋亡参与支持抗风湿药耐药的信号通路。但值得注意的是，p53突变体在体内实验中的作用效果并不清楚，这需要进一步的动物实验研究证实。

 

此外，使用能够绕过p53相关的复杂网络的药物，似乎可以用来克服耐药性问题。如雷公藤红素（Celastrol）能够通过操纵 RAFLS 中的 Ca2+ 信号激活自噬[8]，并通过抑制转运蛋白和诱导 p53非依赖性细胞凋亡来克服癌细胞中的 MTX 抗性（未发表的数据）。

 

最后，该研究代表了一个新的p53概念进展和新的翻译后功能相关发现，这对于指导治疗由p53突变导致的甲氨蝶呤耐药的RA患者非常重要，并有利于进一步开发针对p53突变的抗关节炎药物。