骨关节炎（OA）是一种常见的关节疾病，临床表现为关节疼痛、活动受限和关节畸形等，严重影响患者的工作能力和生活质量。尽管这种疾病的发病率高，但其病因仍不清楚。之前的一些研究发现，骨关节炎与一些患者的高胆固醇水平有关，表明很可能存在一种代谢性骨关节炎表型。不过，胆固醇代谢及其相关基因如何参与骨关节炎的发病机制，目前还知之甚少。有助于开发治疗骨关节炎的新型疗法。

 

 

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员收集了多例骨关节炎患者的组织样本，并使用了前交叉韧带切断术（ACLT）诱导的鼠类骨关节炎模型。在研究LRP3的功能时，他们使用了敲低和过表达LRP3的慢病毒载体，以及LRP3基因敲除小鼠（由赛业生物提供，产品编号：S-KO-10153）。他们还通过番红O和甲苯胺蓝染色来观察软骨形态，并通过IHC染色和免疫印迹分析来研究相关基因的表达。

 

技术路线

01 探索高胆固醇与骨关节炎软骨退变的关系

02 发现胆固醇代谢相关基因LRP3的表达在骨关节炎发展过程中下降

03 通过基因敲除和过表达分析确定LRP3在骨关节炎中的功能

04 通过RNA测序和通路分析确定LRP3的下游分子靶点

 

研究结果

1 LRP3的表达在骨关节炎发展过程中下降

研究人员首先收集了100例接受全膝关节置换术（TKA）的骨关节炎患者及91例非骨关节炎患者的临床数据。他们发现，骨关节炎患者的总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）明显更高，表明高脂血症与骨关节炎发展之间可能存在关联。此外，与常规饮食相比，高胆固醇饮食会诱导小鼠模型发生更严重的软骨退变。

 

接下来，研究人员对两种饮食喂养的小鼠的RNA测序结果进行了全面筛选，发现LDL受体相关蛋白（LRP）家族的表达发生了显著变化（图1）。LRP家族是一组进化上保守的细胞表面受体，参与了胆固醇代谢的调节。具体来说，作为LRP家族中变化最明显的成员，在外源性胆固醇刺激后，LRP3在软骨细胞中的表达（mRNA和蛋白质水平）均显著下降，当炎症因子与胆固醇共同作用时，变化趋势更加明显。

 

图1 高胆固醇导致LRP3在软骨中的表达下调[1]

 

为了进一步阐明LRP3的表达与骨关节炎的关系，研究人员收集了5例骨关节炎患者和5例外伤对照患者的软骨组织，发现LRP3蛋白在骨关节炎软骨中下调。在前交叉韧带切断术（ACLT）诱导的大鼠骨关节炎模型中，软骨的LRP3表达也显著降低。此外在衰老诱导的小鼠骨关节炎模型中也观察到类似的结果。这些结果证实了在骨关节炎发展过程中，LRP3在软骨细胞中的表达下降。

 

2 LRP3正向调节了软骨细胞ECM的代谢

之后，研究人员构建了LRP3敲低和过表达的慢病毒载体，以便鉴定LRP3在骨关节炎中的生物学功能。他们发现，LRP3敲低导致正常大鼠软骨细胞中的合成代谢基因（Col2a1、Acan和Sox9）表达下降，相应蛋白的表达也随之降低。此外，LRP3敲低还诱导了软骨细胞细胞外基质（ECM）的分解代谢（图2）。LRP3的过表达则逆转了这些影响。这些结果表明，LRP3正向调节了软骨细胞ECM的代谢。

 

利用赛业生物构建的LRP3基因敲除小鼠（Lrp3−/−小鼠，产品编号：S-KO-10153），他们进一步确定了LRP3在骨关节炎发病机制中的作用。与野生型对照相比，Lrp3−/−小鼠在第4周和第8周表现出更严重的ACLT诱导的软骨退变（图2）。Micro-CT 3D重建图像显示Lrp3−/−小鼠的异位骨赘显著增加，关节表面也变得更粗糙。同时，自然衰老的Lrp3−/−小鼠也表现出更严重的骨关节炎进展。总的来说，这些结果表明LRP3的缺乏加速了骨关节炎的发展。

 

图2 LRP3正向调节软骨细胞ECM的代谢[1]

 

那么，LRP3过表达是否可以延缓骨关节炎的进展？研究人员将过表达载体注射到在ACLT手术后的大鼠膝关节。通过番红O-固绿染色和IHC染色，他们观察到LRP3过表达显著抑制了关节软骨破坏。OARSI评分也表明过表达LRP3的膝关节表现出较轻的骨关节炎表型。与对照组相比，过表达载体处理组的关节表面更光滑，且异位骨赘的生成也更少。因此他们认为，LRP3的过表达减弱了骨关节炎发生时的软骨退变。

 

3 SDC4作为LRP3的下游分子靶点

为了确定这背后的潜在机制，研究人员对LRP3敲低的大鼠软骨细胞开展了RNA测序分析。他们发现，与软骨退变密切相关的多配体蛋白聚糖4（syndecan-4, SDC4）在Lrp3敲低后显著上调。KEGG通路分析显示，在敲低LRP3后，调控炎症反应导致OA软骨退化的Ras/Raf/MEK/ERK信号通路明显被激活。免疫印迹结果显示，敲低LRP3可显著增加Ras和Raf表达，并显著提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，同时显著增加SDC4的表达。Ras信号通路抑制剂则消除了LRP3敲低诱导的SDC4上调。根据这些结果，他们认为LRP3通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路负向调节软骨细胞中SDC4的表达。

 

为了探究SDC4表达与骨关节炎之间的关系，研究人员在正常大鼠软骨细胞中过表达SDC4，发现COL2A1和ACAN的表达显著降低，而基质金属蛋白酶3（MMP3）的表达增加。MMP3等基质降解酶对软骨ECM的降解是骨关节炎的重要特征之一。将过表达SDC4的慢病毒载体注射到大鼠膝关节后，大鼠表现出更严重的骨关节炎表型。他们还发现，SDC4过表达通过结合和激活ECM降解酶ADAMTS-5来诱导软骨ECM降解，从而加剧软骨退变。

 

图3 胆固醇-LRP3-SDC4通路在骨关节炎软骨退变中的作用[1]

 

文章结论与讨论，启发与展望

总的来说，研究人员发现高胆固醇抑制了LRP3在软骨细胞中的表达，引发软骨ECM代谢的失衡，并导致软骨退变的发展。其中，SDC4作为LRP3的下游分子靶点，参与调节软骨细胞ECM的降解（图3）。LRP3的过表达可以有效延缓骨关节炎的软骨退变。这项研究强调了胆固醇-LRP3-SDC4通路在骨关节炎发病机制中的作用，为骨关节炎的治疗提供了新的潜在靶点。