对于质粒DNA（pDNA）在临床中的应用，无论是作为活性药物成分（API）还是作为工艺中间体，都具有三大要求 - 纯度高、稳定性好、完整性高。随着依赖 pDNA 的新疗法的出现，预计需求将会进一步增加，因此，本文将重点介绍有助于提高 pDNA 产量的生产工艺的最新进展以及生产步骤，以确保产物质量、安全性和有效性。

对于将 pDNA 直接注入人体的基于 DNA 的疫苗、肿瘤疗法或基因疗法，良好生产规范 (GMP) 是绝对必要的。对于基于 RNA 的药物模式，pDNA 作为转录模板产生 mRNA，这一要求的重要性相对较轻，但仍需要适当的质量属性和控制，以确保 mRNA 被正确转录，并防止用于体外转录的中间产物的残留。无论最终用途如何，pDNA 都应该是共价闭合的环状形式并且应该是超螺旋的。一般建议的 pDNA 超螺旋构象的含量 >80%，这是基于以下观点：与其它 pDNA 形式相比，超螺旋形式具有更高的生物活性。

上游工艺优化有可能通过提高起始 pDNA 产量来减少杂质的相对比例，从而显著降低 pDNA 生产成本，并提高下游纯化的效率。

通常，pDNA 是使用大肠杆菌的“普通品种”菌株生产的，例如 DH5α 和 DH10B，这些菌株经过优化和诱变，以提高其在克隆、文库构建和生产高水平重组蛋白方面的性能。尽管这些常见菌株已成功实现其预期目的，但有时它们可能并不是生产 pDNA 产品时最明智的选择。

对于潜在的上游工艺改进，未来的菌株选择可以基于合理设计的菌株，这些菌株可以高保真地保持高浓度的超螺旋 pDNA，并且其细菌外膜的结构可以减少内毒素污染。此外，可以使用不存在转座子风险的菌株。

细菌细胞通常在发酵条件下在由化学成分确定的物质（例如葡萄糖或甘油作为碳源、盐、维生素等）组成的确定成分或基本细胞培养基中生长。典型的质粒发酵培养基和工艺可产生 100 – 500 mg pDNA/L培养基的产量。一些使用标准高拷贝质粒和新型发酵控制参数进行补料分批发酵的研究获得了相对于细胞质量的特定 pDNA 产量的显著增加，在特定情况下可高达 >1,500 mg/L培养基，同时还可增强了 pDNA 完整性并保持超螺旋 DNA 含量。但具体来说，pDNA的产量取决于多方面的因素，包括所用的宿主株以及pDNA的大小和复杂性等。

拷贝数表示存在于细菌细胞中的质粒的平均数量，主要由 pDNA 复制起点决定，但也受生长条件下温度的影响。拷贝数可分为低等：15-20、中等：20-100 或高等 500-700。表面上，pDNA 生产需要高拷贝数，事实上，高质粒拷贝数的优点在于两方面：1.) 随机分区时 pDNA 的稳定性更高；2.) 促进下游纯化，因为 pDNA 通常只占大肠杆菌细胞裂解物大分子的不到 3% 的大分子。

当连接到非常大的 DNA 插入片段时，高拷贝数质粒可能会以中等或低拷贝水平复制，从而导致 pDNA 产量低于预期。这种产量下降是因为质粒复制是宿主细胞的代谢负担，最终，培养物将由现有的无质粒细胞主导，导致质粒产量低。如果是这种情况，则可以使用较低拷贝数的质粒骨架。

下游工艺包括大肠杆菌细胞收获后的所有步骤，旨在去除宿主蛋白质、内毒素、RNA、基因组 DNA 以及线性和开环形式的 pDNA。

尽管存在多种化学和机械裂解技术，但碱裂解（NaOH，pH ~ 12），包括与去污剂（如十二烷基硫酸钠和 Triton® X-100）联合使用，是最常见的方法。裂解孵育时间直接影响 pDNA 的质量和数量，因此需要优化。碱裂解的分子基础是不可逆地破坏基因组 DNA，同时使 pDNA 保持完整。最佳 pH 值因质粒和宿主菌株的类型而异，需要仔细控制，因为即使是轻微的偏差也可能影响产量。碱裂解后，pH值被中和；在此步骤中，均匀混合对于保持 pDNA 质量至关重要。

顾名思义，澄清可去除细胞裂解/中和步骤中产生的沉淀物和碎片。传统上，离心被用于澄清操作，但可能会产生剪切应力，这可能会破坏超螺旋质粒的结构，从而导致产量降低。使用直流过滤的澄清已成为一种更可行的方法。