细胞培养是生命科学领域最重要的技术之一，其“初始”形式是从动物或植物中取出细胞、组织或器官，然后将它们放置到有利于它们生存和/或增殖的人工环境中。细胞最佳生长的基本环境要求是：受控的温度、适当的生长容器以及培养基，并保持正确的 pH 值和渗透压。细胞培养中最重要和关键的一步是选择合适的培养基进行体外培养。生长培养基旨在支持微生物或细胞等的生长。细胞培养基通常包含适当的能量来源以及调节细胞周期的化合物。典型的培养基由氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和附着因子来源的血清组成。除营养物质外，培养基还有助于维持 pH 值和渗透压。

动物细胞可以使用完全天然的培养基培养，或者使用人工/合成培养基结合一些天然产物进行培养。

天然培养基：天然培养基仅由天然存在的生物体液组成。天然培养基对于很多种类的动物细胞培养非常有用，且使用方便。天然培养基的主要缺点是由于缺乏对这些天然培养基的确切组成的了解而导致的重现性较差。

人工培养基：人工或合成培养基是通过添加营养素（包括有机和无机）、维生素、盐、O2和 CO2 气相、血清蛋白、碳水化合物、辅助因子来制备的。已经设计出不同的人工培养基来实现以下一个或多个目的：1）细胞存活（平衡盐溶液，具有特定的 pH 值和渗透压）；2) 延长生存期（补充各种有机化合物和/或血清的平衡盐溶液）；3）“无限”增长；以及4）专门化的功能。

人工培养基大体可以分为四类：

• 含血清培养基：胎牛血清是动物细胞培养基中最常见的添加剂。它被用作获得最佳培养基的低成本添加物。血清为不稳定或水不溶性营养素、激素和生长因子、蛋白酶抑制剂提供载体或螯合剂，并结合和中和潜在的毒性部分。

   

• 无血清培养基：培养基中存在血清有许多缺点，如血清成分缺乏批间一致性，在使用前需要进行检测、以保持每批产品的质量，且可能含有一些生长抑制因子，并可能增加污染的风险，此外，培养基中存在血清可能会干扰细胞培养产品的纯化和分离。行业已开发出多种无血清培养基，这些培养基通常经过专门配制，以支持特定细胞类型的培养，其通常结合明确定义的大量纯化的生长因子、脂蛋白和其它蛋白质。

   

• 化学限定培养基：这些培养基含有无污染的超纯无机和有机成分，还可能含有纯蛋白质添加剂，如生长因子。它们的成分是通过基因工程在细菌或酵母中生产的，并添加了维生素、胆固醇、特定氨基酸和脂肪酸。

   

• 无蛋白培养基：无蛋白培养基不含任何蛋白质，只含有非蛋白质成分。与添加血清的培养基相比，使用无蛋白培养基可促进细胞生长和蛋白质表达，并有利于表达产物的下游纯化。

培养基是含有氨基酸、葡萄糖、盐、维生素和其它营养成分的混合物，可从商业培养基供应商处以粉末或液体形式获得。不同细胞系对这些成分的要求各不相同，这种差异是造成目前市面上存在大量培养基配方的部分原因。培养基设计中的每种成分执行特定的功能，包括：

缓冲体系：调节 pH 值对于实现最佳培养条件至关重要，通常通过以下几种缓冲系统之一实现：

• 天然缓冲体系：在天然缓冲体系中，气态 CO2 与培养基中的 CO3/HCO3含量保持平衡。具有天然缓冲体系的培养物需要在含有 5-10% CO2 的空气环境中维持，通常是 CO2 培养箱。天然缓冲体系成本较低且无毒。

• HEPES：使用两性离子 HEPES 的化学缓冲在 pH 值 7.2-7.4 范围内具有出色的缓冲能力，并且不需要受控的气态环境。对于某些细胞类型，HEPES 相对昂贵且在较高浓度下会产生毒性。HEPES 还被证明可以大大提高培养基对荧光照射引起的光毒性效应的敏感性。

• 酚红：大多数市售培养基都包含酚红作为 pH 指示剂，可以持续监测 pH。在细胞生长期间，由于细胞释放的代谢物，培养基会随着 pH 值的变化而改变颜色。在低 pH 水平下，酚红会使培养基变黄，而在较高 pH 水平下，它会使培养基变紫色。pH 7.4 时培养基呈鲜红色，这是细胞培养的最佳 pH 值。然而，使用酚红存在某些缺点， 首先，酚红模仿某些类固醇激素的作用，尤其是雌激素。因此，对于使用雌激素敏感细胞的研究，建议使用不含酚红的培养基。其次，一些无血清配方中酚红的存在会干扰钠-钾稳态。这种影响可以通过在培养基中加入血清或特定激素来中和。此外，酚红会干扰流式细胞术的检测。

   

无机盐：培养基中的无机盐有助于保持渗透压平衡，并通过提供钠、钾和钙离子帮助调节膜电势。

氨基酸：氨基酸是蛋白质的组成部分，因此是所有已知细胞培养基的必需成分。必需氨基酸必须包含在培养基中，因为细胞不能自行合成这些氨基酸，且是细胞增殖所必需的，它们的浓度决定了可达到的最高细胞密度。L-谷氨酰胺是一种必需氨基酸，尤为重要。L-谷氨酰胺为 NAD、NADPH 和核苷酸提供氮，并作为新陈代谢的次级能量来源。L-谷氨酰胺是一种不稳定的氨基酸，它会随时间转化为细胞无法使用的形式，因此应在使用前添加到培养基中。添加比原始培养基配方中要求的更多的 L-谷氨酰胺时应小心，因为它的降解会导致氨的积聚，而氨会对某些细胞系产生有害影响。哺乳动物细胞培养基的 L-谷氨酰胺浓度从 0.68 mM 到4 mM 不等。无脊椎动物细胞培养基可含有高达 12.3 mM 的L-谷氨酰胺。也可以将非必需氨基酸添加到培养基中以替换那些在生长过程中被耗尽的氨基酸。用非必需氨基酸补充培养基可刺激生长并延长细胞的活性。

碳水化合物：糖类形式的碳水化合物是主要的能量来源。大多数培养基含有葡萄糖和半乳糖，但有些培养基含有麦芽糖和果糖。

蛋白质和肽：最常用的蛋白质和肽是白蛋白、转铁蛋白和纤连蛋白。它们在无血清培养基中尤为重要。血清是蛋白质的丰富来源，包括白蛋白、转铁蛋白、抑肽酶、胎球蛋白和纤连蛋白。白蛋白是血液中的主要蛋白质，其作用是结合水、盐、游离脂肪酸、激素和维生素，并在组织和细胞之间进行运输。白蛋白的结合能力使其成为细胞培养基中有毒物质的合适去除剂。抑肽酶是细胞培养系统中的保护剂，在中性和酸性 pH 值下稳定，耐高温和蛋白水解酶降解。它能够抑制多种丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶。胎球蛋白是一种糖蛋白，在胎儿和新生儿血清中发现的浓度高于成人血清，它也是丝氨酸蛋白酶的抑制剂。纤连蛋白是细胞附着的关键参与者。转铁蛋白是一种铁转运蛋白，可向细胞膜供应铁。

脂肪酸和脂类：它们在无血清培养基中特别重要，因为它们通常存在于血清中。

维生素：许多维生素对于细胞的生长和增殖是必不可少的。细胞不能合成足够数量的维生素，因此后者是培养所需的重要添加物。同样，血清是细胞培养中维生素的主要来源，培养基通常富含不同的维生素，使其适用于特定的细胞系。B 族维生素最常添加用于刺激生长。

微量元素：微量元素通常被添加到无血清培养基中，以取代血清中通常存在的那些元素。铜、锌、硒和三羧酸中间体等微量元素是正常细胞生长所需的微量化学元素。这些微量营养素对于许多生物过程都是必不可少的，例如维持酶的功能。

培养基添加物：用于某些细胞系的完全生长培养基需要添加基础培养基和血清中不存在的额外成分。这些成分、添加物有助于维持增殖和正常的细胞代谢。尽管一些细胞系的正常生长需要激素、生长因子和信号物质等添加物，但需注意以下影响：因为加入添加物会改变完全生长培养基的渗透压，从而对细胞生长产生负面影响，最好在加入添加物后重新检查渗透压。对于大多数细胞系，最佳渗透压应在 260 mOSM/kg 和 320 mOSM/kg 之间。另外，加入添加物后生长培养基的保质期会发生变化。含有蛋白质添加物的完全培养基往往比单独的基础培养基降解得更快。

抗生素：尽管细胞生长不需要抗生素，但抗生素通常用于控制细菌和真菌污染物的生长。一般不建议常规使用抗生素进行细胞培养，因为抗生素会掩盖支原体和耐药细菌的污染。此外，抗生素还会干扰敏感细胞的新陈代谢。

细胞培养基成分的复杂性为优化培养基的各个成分带来了许多挑战。大多数经典培养基都是针对小规模低密度培养而设计的，通常需要血清作为关键营养素。然而，在需要维持高细胞密度和提高细胞生产力的生物制药行业，培养基的开发和优化非常关键。通常，用于生物制药行业的培养基是无血清的，并且具有比传统培养基高得多的营养物浓度。培养基优化需要考虑以下参数：

要生产的目标产品：目标产品的类型将决定培养基优化策略。为了快速到达目标细胞数量，细胞生长速率和活性至关重要。因此，细胞培养基应支持最大细胞生长并在增加细胞密度时维持细胞活性。

对于病毒的生产，不仅需要高细胞密度，而且培养基中必须有丰富的营养物质、以维持感染后的病毒复制。

对于重组蛋白的生产，通常需要高细胞密度。然而，细胞生长可能会与蛋白质生产竞争所需的营养素。因此，仔细确定给定培养基可以维持所需生产力水平的最高细胞密度非常重要。此外，还需要考虑在优化过程中，任何对培养基的更改不应影响产品质量，这一点也非常重要。

使用的宿主细胞系：不同的细胞系具有不同的营养需求，因为新陈代谢的差异决定了培养基优化方法。生物制药行业常用的细胞系有很高的多样性，包括 CHO 细胞、HEK293细胞、BHK-21、杂交瘤细胞以及正常二倍体成纤维细胞等。某些细胞系具有特定的营养需求，例如正常二倍体成纤维细胞需要附着因子来粘附并在表面上展开以进行生长，但它们的生长密度通常很低，因此不需要大量的营养物。杂交瘤细胞系通常高度依赖谷氨酰胺，且通常在达到细胞密度峰值后缺乏稳定期，活性出现迅速下降。因此，培养基的优化将旨在减少活性的下降并提高抗体的产量。

计划采用的生产工艺模式：生产工艺模式不仅会影响细胞培养基的选择，还会影响优化方法。细胞培养中通常使用的不同生产模式包括：

• 批次：单一培养基用于维持细胞生长和生产力。因此，培养基应富含营养物质，但应保持在细胞的生理极限内。

   

• 补料分批：在细胞培养过程中使用多种培养基，具体取决于工艺过程的阶段。生长培养基的设计方式使其在接种期间细胞密度较低时具有较低的营养浓度，但在放大和早期生产期间保持高细胞生长速率。当培养达到生产阶段时，也可以使用具有更高营养物浓度的单独生产培养基。

   

• 灌流：细胞灌流培养通过特定的细胞截留装置去除营养成分耗竭的培养基而将细胞截留在反应器内，同时补加新鲜的培养基，从而维持生物反应器内恒定的培养环境，继而达到相比批次和补料分批模式更高的细胞密度和产物产量。灌流过程需要消耗大量的培养基，也是产品成本的重要影响因素。可以通过分析耗竭培养基中营养物的使用状态，降低或富集灌流培养基中的特定成分，从而在维持所需培养密度和产量的同时，降低灌流速率，优化生产效率。