揭示乙酰化Tau蛋白通过干扰线粒体稳态加剧学习记忆障碍

从阿尔茨海默病（AD）脑组织中分离出的Tau蛋白表现出许多翻译后修饰（PTM），其中磷酸化是最普遍的，也是研究得最多的。最近，有越来越多的证据表明，tau蛋白可以在多个位点被乙酰化修饰，在AD的早期阶段，tau在K274和K281位点的乙酰化明显增加，在严重痴呆的晚期AD患者的大脑中更为显著[1, 2]。在中枢神经系统（CNS）中，神经元生存和活动的能量供应主要依赖于线粒体[3]。线粒体是一种持续进行转运、分裂、融合和自噬的动态细胞器，其融合与分裂主要由两组不同的蛋白来调节，融合蛋白主要包括丝裂融素1/2（Mitofusin 1/2，Mfn1/2）、视神经萎缩蛋白1（Optic Atrophy-1 protein，OPA1），而线粒体分裂则由动力蛋白样蛋白（Dynamin-related protein，DRP1）和线粒体分裂蛋白1（Mitochondrial fission1 protein，Fis1）调控[4]。线粒体功能障碍是AD的一个明显的早期特征，总的或磷酸化的tau蛋白在AD动物模型中的表达会导致线粒体功能紊乱[5]，然而，到目前为止，乙酰化tau蛋白对线粒体功能的影响和机制尚不清楚。

该研究发现，模拟tau蛋白在赖氨酸残基K274和K281位点的乙酰化，导致线粒体生物生成减少，线粒体融合蛋白的表达水平下降，线粒体功能紊乱加剧，从而小鼠认知障碍加重。BGP-15治疗通过促进线粒体生物生成和调节线粒体动态平衡来改善tau蛋白乙酰化引起的学习和记忆损伤。

在tau蛋白的许多潜在的乙酰化位点中，K274和K281已经在人类AD脑中被检测到，为了探讨tau乙酰化对学习记忆的影响，作者构建了模拟乙酰化tau的病毒AAV-hSyn-EGFP-tau（Lys在K274和K281位突变为Gln）3flag（TauKQ），模拟非乙酰化tau的病毒AAV-hSyn-EGFP-tau（Lys在K274和K281位突变为Arg）-3flag（TauKR）和以及未突变的野生型tau 病毒AAV-hSyn-EGFP-tau（野生型tau）-3flag（TauWT），和空载病毒AAV-hSyn-EGFP-MCS-3flag（Vec）作为对照。作者通过脑立体定位将病毒分别注射到2个月大的C57雄性小鼠的背侧海马CA1区，一个月后通过行为学检测发现TauKQ小鼠比TauWT或TauKR小鼠认知缺陷更显著。Neun染色、尼氏染色、高尔基染色证明TauKQ小鼠神经元和树突棘的丢失最严重。作者构建三种tau的慢病毒，在原代海马神经元中过表达后进行MAP2免疫荧光染色，Sholl分析显示三种tau蛋白的过表达都会使神经元树突分支减少，其中最明显的是TauKQ组（图1）。上述实验结果表明，tau在K274/K281位点的乙酰化会导致小鼠学习记忆障碍加重，神经元丢失，树突棘减少，神经元的树突复杂度降低。

图1. 过度表达TauKQ加剧认知损害，伴随神经元丢失、树突棘减少和神经元树突复杂度降低

神经元严重依赖线粒体来满足突触传递的能量需求。为了进一步研究乙酰化模拟tau突变体加重神经元损伤和突触丢失的潜在机制，作者首先检测了tauKQ对线粒体功能的影响。通过Western Blot检测线粒体电子传递链的亚基，发现TauKQ的过表达显著降低了线粒体复合物I和II。过表达三种tau蛋白，ATP产生水平也显著降低，在TauKQ组更为显著。为了进一步探讨tau乙酰化对线粒体功能的影响，作者将慢病毒（TauWT、TauKQ和TauKR）感染原代培养的海马神经元，通过DCFH-DA检测细胞内ROS，MitoSOX检测线粒体ROS，以及TMRE检测线粒体膜电位水平。结果发现三种tau的过表达均导致细胞内和线粒体ROS产生增加，线粒体膜电位受损，且在TauKQ组最为明显（图2）。上述结果提示，tau在K274/K281位点的乙酰化加剧了线粒体功能障碍。

图2. 过度表达TauKQ加剧线粒体功能障碍

为了研究乙酰化模拟tau突变体加剧线粒体功能障碍的机制，作者检测了与线粒体生物发生相关的蛋白质，包括过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α（PGC-1α）、核呼吸因子1（NRF1）和线粒体转录因子A（TFAM），它们在神经退行性疾病（如AD）中的表达显著降低，表明线粒体生物发生（mitochondrial biogenesis）减少。在原代培养的海马神经元和小鼠海马区CA1区，过表达TauKQ降低了PGC-1α、Nrf1和Tfam，TauKR和TauWT与TauKQ相比，PGC-1α、Nrf1和Tfam的水平有所恢复，但与空载对照组相比没有显著差异。TauWT和TauKR组线粒体外膜蛋白TOMM40的表达也增加，尽管TauKQ逆转了这一趋势，这可能是由于线粒体生物发生减少所致。过度表达TauWT、TauKQ或TauKR也增加了自噬标记LC3（微管相关蛋白1轻链3）-II和p62（SQSTM1），这表明自噬受到了损害。实时荧光定量聚合酶链式反应显示，TauKQ过表达后，PGC-1α、NRF1或TFAM mRNA水平显著下降。为了进一步验证线粒体生物发生是否受到损害，作者测量了线粒体DNA的相对拷贝数(mtDNA/nDNA），发现TauWT和TauKR小鼠的mtDNA/nDNA增加，而TauKQ小鼠的mtDNA/nDNA减少（图3），这表明乙酰化模拟tau突变体抑制线粒体的生物发生。

图3. 过度表达TauKQ降低线粒体生物发生

线粒体经历着裂变和融合的协调循环以维持其形状、分布和大小，被称为 "线粒体动力学（mitochondrial dynamics）"。在原代培养的海马神经元中过表达TauWT后，通过Western Blot检测到线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1的表达增加，而线粒体裂变蛋白Fis1和Drp1没有变化。然而，与Vec或TauWT组相比，TauKQ的过表达明显降低了Mfn1、Mfn2和Opa1的水平；而与TauKQ组相比，TauKR的过表达增加了Mfn1、Mfn2和OPA1的水平，同时与Vec组相比，Mfn1和Mfn2的水平有所增加。在过表达三种类型的tau后，用MitoTracker Red染料标记线粒体，发现过表达TauWT和TauKR，线粒体长度明显增加，而过表达TauKQ后，线粒体长度减少。与Vec组相比，TauWT在小鼠海马CA1区的过表达增加了Mfn1、Mfn2和Opa1的mRNA和蛋白水平，过表达TauKR上调了Mfn1和Opa1水平，而TauKQ明显减少了这些融合蛋白的表达水平。线粒体分裂蛋白在体外和体内没有明显变化。为了进一步证实乙酰化tau对线粒体动力学的影响，作者通过电子显微镜检测线粒体形态，观察到TauWT和TauKR小鼠海马CA1区神经元中线粒体的延长（线粒体长度/直径之比大于4.5）占很大比例，并伴随线粒体嵴的少量丧失，而TauKQ诱发线粒体碎片化（线粒体长度/直径之比等于1~1. 5），线粒体形态变圆且肿胀，线粒体嵴严重丧失，出现空泡状（图4）。所有上述数据表明，tau K274/K281的乙酰化通过破坏线粒体动态平衡（促进线粒体裂变）和抑制线粒体生物生成而加重了线粒体功能障碍，进而导致神经元损失和树突棘损伤。

图4. 过度表达TauKQ通过减少线粒体融合来破坏线粒体动力学

BGP-15是一种羟胺衍生物，已被证明在体内和体外的多种模型中发挥细胞和神经保护作用，涉及的机制包括增加线粒体融合蛋白和通过PGC-1α信号通路促进线粒体生物发生。接下来，作者旨在研究BGP-15是否能减弱TauKQ诱导的线粒体损伤从而减轻小鼠的认知障碍。通过对原代培养的海马神经元进行MAP2免疫荧光染色，观察到BGP-15处理显著改善了TauKQ过表达诱导的神经元树突复杂度的降低。通过Neun免疫荧光染色和尼氏染色，观察到BGP-15处理逆转了过度表达TauKQ导致的神经元数量减少。高尔基染色显示BGP-15治疗改善了TauKQ诱导的小鼠树突棘的丢失。最后，作者进行了行为测试来评估认知能力，发现BGP-15改善了TauKQ小鼠的学习记忆能力（图5）。这些数据表明，BGP-15治疗改善了TauKQ诱导神经元丢失，树突棘的减少以及小鼠的认知障碍。

图5. BGP-15通过改善神经元丢失和树突棘减少以及增加神经元树突复杂性来挽救认知障碍

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究结合生物化学、细胞生物学及行为学等多种手段，揭示tau在K274/K281位点的乙酰化（TauKQ）具有比野生型tau和非乙酰化tau更严重的神经毒性。它通过减少线粒体的生物发生，扰乱线粒体的动态平衡，导致线粒体功能失调，从而加重认知功能障碍。作者还发现，BGP-15通过促进线粒体的生物发生和融合，逆转了TauKQ诱导的线粒体功能失调和认知障碍，证明了BGP-15在神经疾病模型中的潜在用途。本文不足之处是，虽然重组KQ突变体（赖氨酸残基被谷氨酰胺取代，作为乙酰赖氨酸的模拟物）和KR突变体（用精氨酸取代赖氨酸残基作为非乙酰化赖氨酸的模拟物）被广泛用于研究乙酰化的影响，但也存在一些局限性。首先，使用的突变tau是100%在这些Lys残基上被乙酰化或非乙酰化，考虑到PTMS的动态调节，这不符合生理规律。其次，当KQ突变体被用作乙酰化赖氨酸的模拟物时，可能会高估体内乙酰化的影响。例如，Ku70环上的赖氨酸残基的乙酰化并没有明显降低Ku对DNA的亲和力[6]。