建立基于dCas9的HDR定点提升策略

CRISPR/Cas9基因编辑利用Cas9核酸酶及伴随的小向导RNA（sgRNA）定点产生DNA双链断裂（DNA double strand break, DSB），依靠细胞自身的DSB修复机制完成修复，产生包含编辑产物的修复产物[1]。哺乳动物细胞主要利用同源序列介导修复（homology-directed repair，HDR）和非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）两条保守途径修复DSB，这两条修复途径相互竞争，但大部分DSB通常由NHEJ修复。因此，利用NHEJ小分子抑制剂，比如DNA-PKcs抑制剂NU7441或DNA ligase 4抑制剂SCR7，可以推动HDR途径选择，提高HDR介导的CRISPR基因编辑[2,3]。但是，小分子化合物的全局性NHEJ抑制在脱靶位点同样发挥作用，加剧脱靶效应[4]。因此，建立一个NHEJ定点抑制策略在基因编辑应用中具有重要价值。

揭示结合到DSB断点附近的酶失活的Cas9（dCas9）可以阻碍NHEJ核心因子对末端的识别和结合，从而定点抑制NHEJ、提升该位点的HDR效率。在此基础上，该团队建立基于dCas9末端临近结合的提升HDR介导的基因编辑效率的策略，并同时避免类似于NHEJ小分子抑制剂的脱靶恶化效应[5]。

先前发现，Cas9在有的靶点结合能力强、滞留时间长，因此在NHEJ和HDR途径选择中HDR选择偏向性加强；而在结合能力弱、滞留时间短的靶点，NHEJ的竞争更具优势[4,6]。这提示dCas9的末端结合也可能影响靶点修复途径的选择。于是，本研究中，该团队将酶失活的化脓性链球菌Cas9（即dSpCas9）靶向到I-SceI、LbCas12a和SaCas9诱导的DSB的末端临近位点，发现HDR效率增加，这个提升效果既依赖于dSpCas9靶点与断点的距离（通常要在100bp以内），也依赖于dSpCas9的靶点结合能力（图1A-C）。先前已有研究报道，dSpCas9结合到FnCas9、CjCas9、NcCas9和FnCpf1靶点附近可以提升这些CRISPR核酸酶的基因编辑效率，并认为这是由于dSpCas9的靶点结合导致临近染色质结构的开放，从而帮助CRISPR核酸酶识别、结合和切割其靶DNA[7,8]。然而，谢安勇团队在NHEJ核心因子缺失的细胞中测试了dSpCas9临近结合对DSB末端的HDR效率的影响，发现在DNA-PKcs^–/–、KU80^–/–和XRCC4^–/–细胞中，不同于同基因型背景的野生型细胞，dSpCas9的末端结合将不再导致HDR效率的提升，这表明细胞中核心NHEJ因子的存在是实现HDR效率提升的必要条件，而不是借助dSpCas9介导的染色质开放（图1A-C）。为了直接证明dSpCas9的临近结合是通过与NHEJ因子的占位竞争抑制NHEJ，该团队开展了染色体免疫共沉淀（ChIP）实验，发现dSpCas9的末端结合有效阻止NHEJ核心因子Ku80在DSB末端的结合（图2A）。这表明，dSpCas9末端结合直接阻碍NHEJ核心因子参与NHEJ修复机器在末端的组装，迫使细胞更多采用HDR途径进行修复。

图1. dCas9末端临近结合提升HDR依赖NHEJ核心因子的存在。在带有HDR报告系统的细胞中，将dSpCas9结合到I-SceI（A）、LbCas12a（B）或SaCas8（C）诱导的DSB末端临近位置，可以提升DSB的HDR效率，然而这个提升在DNA-PKcs^-/-、Ku80^-/-和XRCC4^-/-细胞中不发生。

（图源：Feng, et al., Nucleic acids research, 2023）

随后，该团队测试了这个HDR提升策略在基因编辑中的可能应用，发现dSpCas9的临近结合可以提高以单链DNA或双链DNA为同源模板的HDR介导的基因校正效率以及以双链DNA为同源模板的HDR介导的大片段基因靶向敲进效率，而且提升效果与DNA-PKcs抑制剂的效果相当（图2B）。不同的是，DNA-PKcs小分子抑制剂导致脱靶效应加重，而基于dSpCas9临近结合的策略却不会产生额外的脱靶效应。此外，因为SpCas9-sgRNA高特异性变体（比如eSpCas9，SpCas9-HF1和截短sgRNA）可以提高基因编辑的安全性，但通常以效率降低为代价，团队因此测试了基于dSaCas9的临近结合对这些SpCas9-sgRNA变体诱导的HDR效率的影响，发现dSaCas9的临近结合也同样可以提升SpCas9-sgRNA变体诱导的HDR效率，并利用该策略改进了SpCas9-sgRNA高特异性变体诱导的HDR介导的基因编辑效果（图2C）。

图2.dCas9末端临近结合提升HDR介导的基因编辑。（A）dSpCas9临近结合LbCas12a诱导的末端阻碍Ku70/Ku80结合DNA末端的工作示意图。（B）dSpCas9末端临近结合提升LbCas12a诱导的HDR效率。（C）dSaCas9末端临近结合提升eSpCas9诱导的HDR效率。

（图源：Feng, et al., Nucleic acids research, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

本研究将dCas9结合到DSB断口的附近，可以有效阻碍核心NHEJ因子的末端结合，定点抑制NHEJ、推动HDR。这个dCas9末端临近结合策略可以定点提升HDR介导的基因编辑效率，并在基因编辑中同时避免了类似于NHEJ小分子抑制剂的脱靶恶化效应，提高了安全性。