揭示Notch下游miR-342-5p介导流体剪切力促进内皮细胞动脉化的分子机制

血管形成是指在已有血管基础上，内皮细胞（endothelial cell, EC）通过增殖、迁移及分化等过程形成新的血管。在这一过程中，EC发生动脉化获得动脉表征，是促进新生血管成熟、形成结构功能完整的血管的重要步骤。既往研究表明，EC动脉化缺失可引起血管结构功能异常，是导致缺血性疾病产生的重要原因。因此，深入研究EC动脉化的调控机制具有重要的理论意义和临床应用价值。前期研究显示，血流引起的流体剪切力（flow shear stress, FSS）是促进并维持EC动脉化的关键因素，Notch受体作为力响应受体可介导FSS抑制下游MYC表达及其活性，下调EC增殖并促进EC动脉化，然而其下游分子机制仍有待于进一步阐明。

该研究在研究者课题组前期研究发现Notch信号下游miR-218、miR-342-5p以及miR-223-3p等多种miRNAs的基础上，进一步证实miR-342-5p可作为一种机械力响应分子，介导FSS及Notch信号促进EC动脉化并可改善缺血性疾病进程，这一功能通过直接靶向抑制EYA3，进而提升MYC蛋白的T58位点磷酸化水平，从而降低MYC蛋白稳定性来实现。该研究在揭示miR-342-5p促进EC动脉化的上下游机制基础上，为EC动脉化相关的缺血性疾病治疗提供了理论依据。

首先，体外利用Ibidi流体剪切力系统模拟FSS，作用人脐静脉内皮细胞（HUVECs) 12及24 h后，qRT-PCR结果显示FSS可显著上调miR-342-5p及其宿主基因EVL的表达水平（图1A）。进一步，在FSS条件下加入DAPT阻断Notch信号，qRT-PCR结果显示，Notch信号阻断可降低FSS对miR-342-5p及EVL的表达水平的上调作用（图1B），表明FSS通过活化Notch信号上调miR-342-5p表达。紧接着，对miR-342-5p过表达及对照的HUVECs进行转录组测序，GSEA及Heatmap分析结果显示FSS应答相关分子在miR-342-5p过表达组显著富集（图1C和D），qRT-PCR及western blot证实miR-342-5p过表达可显著上调FSS响应分子KLF2和KLF4的表达（图1E和F）。研究者进一步在FSS作用背景下阻断miR-342-5p，荧光显微镜下观察细胞发现，miR-342-5p阻断可导致HUVECs的极性消失（图1G），并伴随FSS响应分子KLF2和KLF4的表达水平显著降低（图1H和I）。这部分结果表明miR-342-5p介导ECs对FSS的应答。

图1 miR-342-5p是一种机械转导miRNA，促进EC对FSS的应答

（图源：Xiaoyan Zhang. et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2023）

随后，对miR-342-5p及对照HUVECs转录组数据进行分析发现并结果实验证实，miR-342-5p过表达上调一系列动脉相关基因表达，如EFNB2、GJA4以及GJA5等，而下调多种静脉相关基因表达，如EPHB4、NRP2以及NR2F2等（图2A-D）。进一步，体内多种组织利用CD31抗体及miR-342-5p探针进行组织原位杂交染色（FISH）发现，miR-342-5p在动脉EC中表达较高。紧接着，利用Matrigel plug和视网膜新生血管两种体内模型进一步证实miR-342-5p过表达可促进EC动脉化，而阻断miR-342-5p可导致这一过程减弱。此外，体内外阻断miR-342-5p可显著降低FSS及Notch信号活化引起的动脉基因上调水平，表明miR-342-5p介导FSS及Notch信号促进EC动脉化。

图2 miR-342-5p过表达促进EC动脉化，而阻断抑制EC动脉化

（图源：Xiaoyan Zhang. et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2023）

近期，文献及研究者课题组研究表明Notch信号活化抑制MYC及其下游基因表达水平，抑制EC细胞周期进展并促进EC动脉化。研究者对转录组数据分析结合实验证实发现，miR-342-5p过表达显著下调MYC及其下游相关靶基因的表达水平。进一步，在miR-342-5p过表达的基础上过表达MYC可有效阻断动脉标志分子表达，而上调静脉标志分子的表达。在机制分析上，研究者发现miR-342-5p可上调MYC蛋白T58位点磷酸化水平，而降低其S62位点磷酸化水平，进而降低MYC蛋白稳定性，加速其降解。进一步进行下游靶基因预测及验证发现，miR-342-5p可直接靶向抑制EYA3。EYA3过表达可提升MYC蛋白S62位点磷酸化水平，稳定MYC蛋白，并显著阻断miR-342-5p对EC动脉化的促进作用。这部分研究表明，miR-342-5p可通过直接靶向EYA3改变MYC蛋白磷酸化状态，从而降低MYC蛋白稳定性，进而抑制EC细胞周期及动脉化。

前期研究表明，EC动脉化在缺血性疾病的血流恢复中具有重要意义。为此，研究者对小鼠一侧下肢动脉进行结扎建立下肢缺血模型，并在此基础上肌肉注射miR-342-5p agomir，以检测miR-342-5p对缺血性疾病的治疗作用。通过FISH染色发现，结扎动脉内皮中miR-342-5p表达水平显著降低（图3A）。进一步，肌肉注射miR-342-5p agomir，利用多普勒成像仪分别在第7天和第14天分析结果显示，miR-342-5p agomir可显著提升下肢的血流灌流水平（图3B）。进一步组织免疫荧光染色分析发现，miR-342-5p agomir组的EC中动脉标志分子GJA4表达上调，同时α-SMA+平滑肌细胞覆盖显著增多（图3C和D）。这部分结果表明，miR-342-5p可作为治疗缺血性疾病的潜在靶点。

图3 miR-342-5p促进下肢缺血中的血液灌流

（图源：Xiaoyan Zhang. et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2023）

图4 研究机制图

（图源：Xiaoyan Zhang. et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究发现miR-342-5p作为一种机械力感受分子，受Notch信号介导的FSS上调。在EC中，miR-342-5p介导FSS及Notch信号直接靶向抑制EYA3，降低MYC及其下游分子表达水平，进而促进EC动脉化及提升血液灌流（图4）。本研究结果表明，miR-342-5p可能是治疗缺血性疾病的重要治疗靶点。然而，本研究结论主要基于体外细胞及体内小鼠模型研究，其作为靶点用于相关疾病治疗的有效性仍需要进一步深入研究。