血栓形成可以发生在许多泛血管病中，例如在动脉硬化中，血栓形成可以导致心肌梗死和脑卒中。这一项研究通过使用蛋白质组学策略和激光捕获显微切割技术，对从心肌梗死或脑梗死患者收集的两种动脉血栓进行了空间解剖，寻找新的治疗靶点，以促进动脉血栓溶解。

血栓的异质性组成对溶栓治疗效果产生了重要影响，其中包括纤维蛋白和血小板聚集形成的硬区域和富含红细胞的软区域。因此，我们首先在急性心肌梗死患者的冠状动脉血栓进行软组织和硬组织的空间蛋白质组学分析。我们采用激光显微切割技术来对血栓生物检样品进行Masson三色染色阳性的富含纤维素的区域（硬组织）和富含缺乏纤维素的区域（软组织）进行空间和特异性切割，如工作流程图所示（图1A）。为了增加蛋白质组学分析的权重进行了两个独立的队列，并比较了来自第一队列（3名患者）和来自第二队列（4名患者）的冠状动脉血栓中的差异蛋白值（p值小于0.05且FC大于1.3）。在比较冠状动脉血栓的硬组织和软组织后，我们比较了两个患者队列之间的差异蛋白。我们确定了7种共同的差异蛋白，包括4种上调蛋白质（MTHFD1 [甲基四氢叶酸脱氢酶、环化酶和甲酰四氢叶酸合酶1]、TGF-β1、H1-3 [组蛋白簇1 H1家族成员3] 和 COL1A1）和3种下调蛋白质（APCS [淀粉样蛋白p组分、血清]、PROS1 [蛋白S1] 和 ATP5F1D [ATP 合酶 F1 亚单位δ]；图1B）。由于 TGF-β1 是最显著的上调蛋白质之一，并且它与纤维化密切相关，我们进一步验证了人冠状动脉血栓中 TGF-β1 的表达。免疫荧光染色显示在成纤维细胞（vimentin+）中TGF-β1 阳性细胞的百分比高于总细胞数（图1C）。接下来，我们使用FeCl3诱导血栓形成的小鼠模型来研究TGF-β1在动脉血栓形成中的作用（见图1D）。我们进行了一个功能性实验，结果显示，在给小鼠注射TGF-β1抑制剂后，平均第一次凝结时间显著延长，比生理盐水对照组长（412秒 vs 151秒；见图1D和1E）。此外，TGF-β1抑制剂处理组的平均最终血管闭塞时间比生理盐水对照组长270秒（见图1D和1E）。为了检验TGF-β1在更具临床意义的场景中的作用，我们在血栓形成后将小鼠治疗了TGF-β1抑制剂和r-tPA的组合。根据我们的结果，我们发现使用r-tPA和TGF-β1抑制剂的联合治疗（3小时时间点均值为基线的76.03%）与仅使用r-tPA相比，显著增加了血流量（3小时时间点均值为基线的52.17%；见图1F）。

图1. 空间蛋白质组学揭示了硬区与软区冠状动脉衍生血栓的特征

（图源: Mai, et all. Stroke, 2023）

我们进一步扩大了这项研究的范围，对11例患有脑梗死的患者收集的颈动脉血栓进行了空间蛋白质组学分析。然后，我们将从两种类型（第一个队列和第二个队列）的血栓中鉴定出的差异表达蛋白质整合到生物学过程分析中。第一队列的基因本体富集通路分析显示，在颈动脉和冠状动脉血栓中分别发现了85和284个数据集。在第二队列中，在颈动脉和冠状动脉血栓中分别鉴定出了401和362个数据集（图2A），并在两个队列的两种动脉来源血栓中都发现了5个基因本体富集数据集（图2B），与血小板激活（血小板α颗粒）、细胞质囊泡和内腔以及细胞释放机制（分泌颗粒内腔、囊泡内腔和血小板α颗粒内腔；图2C至2F）有关。

图2.颈动脉和冠状动脉衍生血栓的成对空间蛋白质组学分析揭示了特征基因和路径

（图源: Mai, et all. Stroke, 2023）

我们的发现与先前的研究结果一致，即血小板是血栓硬区域的主要成分，在活化过程中释放TGF-β1。除了TGF-β1外，我们发现COL1A1是两个队列中颈动脉和冠状动脉血栓共同的另一个突出的失调蛋白质（图3A和3B）。有趣的是，已经报道TGF-β可以刺激小鼠胆管细胞中COL1A1的表达。此外，我们发现COL1A1在冠状动脉和颈动脉血栓中都上调（图3B），在第一队列中坚硬血栓区域的表达平均增加了1.7倍（图3C），而在第二队列中平均增加了2.3倍（图3D）。此外，我们通过免疫荧光染色验证COL1A1蛋白在患者血栓的硬区域中表达（图3E）。最后，我们进行SMA免疫荧光染色以可视化标记血管壁的平滑肌细胞，并验证COL1A1在小鼠颈动脉内腔的血栓中组装（图3F）。

图3.空间蛋白质组学揭示了颈动脉和冠状动脉血栓中一种常见的上调蛋白

（图源: Mai, et all. Stroke, 2023）

图4.机制图

（图源: Mai, et all. Stroke, 2023）