单细胞转录组(Single cell RNA)技术的应用非常广泛。它可以帮助研究人员鉴定和分类不同的细胞类型,揭示不同细胞状态和发育过程中的基因表达动态变化,以及探索细胞在疾病发生和进展中的作用。通过单细胞转录组技术,研究人员可以更全面地了解复杂组织和器官中的细胞异质性,并揭示细胞间的相互作用和信号传递机制。
虽然单细胞转录组技术具有许多优势,但也存在一些挑战。其中,首要的一个挑战是组织解离,即将组织样本分解为单个可测序的细胞。单细胞组织解离并不是一个广泛适用的实验方法,具体取决于组织类型、物种、处理环境及其他因素,但以下是一些常见的挑战:
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组织样本的异质性:组织是由不同类型的细胞组成的,这些细胞具有不同的形态、大小和黏着性。因此,解离过程中可能需要针对不同细胞类型采用不同的解离方法。
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细胞黏附力和聚集性:某些细胞类型具有较强的黏附力和倾向于在组织中形成聚集。这使得单个细胞的分离变得更加困难,并且可能导致细胞的受损或聚集的误解。
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细胞脆弱性:某些细胞类型对于机械或化学应激非常敏感,容易受到损伤。在解离的过程中,可能会发生细胞膜破裂、核酸释放或细胞器破坏等现象。
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细胞存活率和完整性:解离过程中,细胞的存活率和完整性是关键指标。一些细胞可能无法生存下来或在解离过程中损失重要的细胞器和分子。
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试剂选择和优化:选择适当的解离试剂和优化解离条件是关键。试剂的种类、浓度和处理时间需要根据具体的组织类型和研究目的进行精确调整。
安升达基于大量的研发测试和项目经验积累,总结了常见及疑难样本的解离方法,助力广大研究者打破这一困境。下面小编带大家一起看看解离报告吧。
神经节(小鼠)
神经节中的神经元通常通过细胞间连接紧密相连。这些细胞间连接可以是突触连接或胶质细胞之间的联系。这种紧密连接增加了从神经节中分离单个细胞的挑战。另外,神经节组织通常由较为柔软的组织组成,如神经元、胶质细胞和血管组织。这种柔软的特性可能导致组织解离过程中的细胞破坏或细胞损失。

解离结果
细胞活性:92.1%
活细胞浓度:3.76x105 cells/mL 活细胞数:35
死细胞浓度:2.97x104 cells/mL 死细胞数:3
胰腺(小鼠)
胰腺是消化系统中一个重要的器官,含有丰富的消化酶。这些酶具有高度活性,可以在组织解离的过程中降解细胞膜和细胞间连接,导致细胞受损。因此,需要抑制这些消化酶的活性,以防止细胞损伤和失活。另外,胰腺组织中的细胞通常与周围的细胞和细胞外基质紧密黏附在一起。这种黏附状态增加了细胞解离的难度,需要使用适当的酶和预处理步骤来减少细胞间的黏附。

解离结果
细胞活性:91.04%
活细胞浓度:6.83x106 cells/mL 活细胞数:691
死细胞浓度:6.72x105 cells/mL 死细胞数:68
肌肉组织(小鼠)
肌肉组织中含有丰富的结缔组织,如肌腱和筋膜。这些结缔组织具有较高的机械强度和抗酶解性,使得解离肌肉组织变得困难。结缔组织的存在会导致组织块之间的粘连,从而阻碍细胞的有效解离。肌肉组织中的肌纤维和肌原纤维具有较强的粘附性,容易在解离过程中聚集在一起形成肌束或肌原纤维团块。这些聚集体可能需要进一步处理才能获得单个细胞。

解离结果
细胞活性:90.6%
活细胞浓度:4.74x105 cells/mL 活细胞数:131
死细胞浓度:4.23x104 cells/mL 死细胞数:13
视网膜(人)
视网膜中的神经元层,包括感光细胞(如视锥细胞和视杆细胞)和神经节细胞,密集排列在一起。这些细胞间的紧密连接增加了从视网膜中分离单个细胞的挑战。除此之外,视网膜细胞具有相对脆弱的结构,包括细长的神经突起和薄弱的细胞膜。在组织解离过程中,细胞可能容易破裂或受损,导致细胞功能的丧失。

解离结果
细胞活性:92.7%
活细胞浓度:9.61x105 cells/mL 活细胞数:392
死细胞浓度:7.6x104 cells/mL 死细胞数:31
肾皮质(小鼠)
肾皮质组织由多种细胞类型组成,包括肾小管上皮细胞、间质细胞、血管内皮细胞和肾小球细胞等。这些细胞具有不同的形态和功能,导致解离过程中细胞类型的选择性和纯度的挑战。肾皮质组织中的细胞通常通过黏附分子和细胞间连接紧密结合在一起。这种细胞黏附状态使得解离单个细胞变得困难,并且需要使用适当的酶和预处理步骤来减少黏附力。

解离结果
细胞活性:90.8%
活细胞浓度:1.20x106 cells/mL 活细胞数:491
死细胞浓度:1.23x105 cells/mL 死细胞数:50
口腔黏膜纤维化组织(人)
纤维化是一种复杂的病理过程,涉及到多种细胞类型和分子信号的相互作用。纤维化组织的结构通常与正常组织有明显差异,例如细胞排列紊乱、基质成分的改变等。这种结构的改变使得纤维化组织解离时需要面对不同的细胞类型和分子信号,增加了解离的难度。
解离结果
细胞活性:86.7%
活细胞浓度:9.88x105 cells/mL 活细胞数:403
死细胞浓度:1.52x105 cells/mL 死细胞数:62
好的解离结果离不开好的样本制备,下面是关于单细胞样品在取样时候的一些建议及注意事项。
新鲜组织样本(组织保存液)
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组织保存液应始终保持2-8℃的储存/运输温度,收到后4℃冰箱避光冷藏,避免冷冻;
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直接将清洗干净的样本切割成0.5cm-1cm 左右的组织块,尽量不超过1cm,保证组织块能够充分接触组织保存液,放入加满组织保存液(2-8℃预冷)的离心管中,样本必须完全被组织保存液浸没;
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用于运输时,将离心管用封口膜封好,避免气泡,防止与空气长时间接触;
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2-8℃避光保存,可在48h 内维持组织样本一定的胞存活率及完整细胞表位;
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避免样品管直接接触冰袋,外面必须包裹纱布或棉花,防止组织冻存;
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样品管上标注样品名称,取样时间精确到X 时,在组织保存液储存最佳时间内保证最原始组织样本状态。
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保存后的组织可直接用于后续实验和研究。由于本品含抗氧化剂,为防止受到抗氧化剂干扰,组织样本可用生理盐水或磷酸盐酸冲液浸润清洗2-3次。
新鲜血液样本
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将外周血收集至适当规格的抗凝血管(如:EDTA抗凝/枸橼酸盐/肝素),轻轻颠倒混匀,室温静置1h,转至4℃保存。
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碎冰或4℃运输,24h内到达实验室。
组织样本冻存
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将离体组织用PBS清洗3遍,剪去坏死和多余的筋膜组织,用纱布以点蘸的方式轻轻吸去组织表面水分,称重约200mg(黄豆大小)分装至1.5mL 预冷的冻存管中(冻存管提前标注组织类型,样品名称和冻存时间)。每个样品须分开准备两个备份,一个备份进行组织质检,一个备份进行细胞核分离。备份可以较小约60mg(绿豆大小)。
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迅速转至液氮中冻存组织,或迅速将管子插入粉末状的干冰中放置10min,后转至-80℃冰箱保存。
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干冰寄送。
细胞样本冻存
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在开始冷冻保存之前,先将细胞冷冻容器(如:程序降温盒)放在冰上或4度预冷。
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将细胞放置冰上。
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用移液器混合细胞,检测细胞活性和细胞量,每2*106个细胞分装一个1.5ml EP管。
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300g,4℃,5min离心。
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去上清,加入1ml细胞冻存液重悬细胞。
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将重悬后的细胞悬液转入冻存管,做好标记,放入冷冻容器转入-80℃冰箱过夜,-80℃可保存5-7天。
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干冰寄送。
小结
安升达单细胞组织解离经验包括但不限于:血液PBMC、骨髓血、肺、肌肉、神经节、腿骨、胰腺、子宫、脑组织、皮下肿瘤、肾脏、肾穿刺、肾小球心脏、肝脏、皮肤、睾丸、生物瓣膜、鼻咽癌、口腔纤维化组织、淋巴结、脑脊液、胃癌组织、肺癌组织、甲状腺、食管鳞癌、肺泡灌洗液、骨母细胞、胰腺穿刺、结肠癌、视网膜等。除此之外,对植物的原生质体制备和解离也有丰富的经验。
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