7月14日，渤健(Biogen)向中国国家药品监督管理局药品审评中心递交ASO药物——托夫生注射液(Tofersen)的上市申请，并获得受理。此前，Tofersen获FDA加速批准上市，成为首个针对遗传性肌萎缩侧索硬化症的基因靶向疗法。
图片来自https://www.cde.org.cn/
肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种进行性神经退行性疾病，俗称“渐冻症”。疾病导致患者大脑与脊髓中的运动神经元丧失。随着疾病进展，ALS患者逐渐失去移动、说话、吞咽和呼吸等能力，ALS患者在确诊后平均寿命小于5年。
研究表明许多基因与该疾病相关，其中超氧化物歧化酶（SOD1）的突变蛋白与运动神经元退化有关。SOD1-ALS是遗传性或家族性ALS的第二种最常见形式，占家族性ALS的20%和所有ALS病例的2%。
Tofersen是渤健和Ionis联合开发的一款反义寡核苷酸（ASO）药物，针对超氧化物歧化酶1突变导致的肌萎缩侧索硬化症。ASO通过与SOD1 mRNA杂交，使SOD1 mRNA被使其被核糖核酸酶RNase-H降解，减少突变的SOD1蛋白生成。
图片来自Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models；ASO1和ASO2靶标到SOD1 mRNA的3’ UTR，此前报道的ASO 333611靶标到SOD1 mRNA的第一号外显子。ASO含有硫代磷酸骨架修饰(未修饰的磷酸二酯键用红色的o表示，橙色表明2’-MOE修饰，蓝色表明cEt修饰)。临床前实验表明ASO1与ASO2比ASO 333611生物活性更好，后续选择ASO1进行后续临床试验。
临床研究表明反义寡核苷酸BIIB067（tofersen）可以降低SOD1-ALS患者脑脊液中的SOD1蛋白的浓度，并且降低了血浆中与ALS进展相关的生物标志物神经丝蛋白轻链（NfL）的水平。
图片来自文献Trial of Antisense Oligonucleotide Tofersen for SOD1 ALS
Tofersen的上市拓宽了ASO药物的应用领域，证明了ASO药物的商业价值。渤健的研发管线中也有针对其他神经系统疾病的多款ASO药物。
图片来自https://www.biogen.com/science-and-innovation/pipeline.html
何为ASO
ASO(antisense oligonucleotide，反义寡核苷酸)通常由12~25个核苷酸组成，进入细胞后可以与RNA进行碱基互补配对，通过不同的机制，调控基因表达。
ASO的探索起源于1978年的一项研究，作者在文章里设计了一条寡核苷酸靶向Rous肉瘤病毒的一段RNA序列，并表明这条寡核苷酸在组织培养基中可抑制病毒复制。此后关于ASO的研究广泛展开；19世纪80年代，研究者们开始将ASO应用到药物发现中。
ASO常见化学修饰
对ASO进行化学修饰主要目的是：增加ASO对靶标RNA的亲和力；增强ASO的核酸酶抗性；获得更好的药代动力学特性；减少免疫原性。随着人们对核酸结构、生化特性的理解，ASO的化学修饰目前聚焦在磷酸骨架和核糖上。
1. 磷酸骨架修饰
目前应用广泛的磷酸骨架修饰有硫代(PS)、磷酰二胺吗啉代(PMO)和肽核酸(PNA)。
PS修饰赋予ASO显著的核酸酶抗性。虽然每个硫代修饰会使ASO对靶标RNA结合的Tm值降低0.2℃~0.5℃，但是通过其他修饰，比如核糖2'位修饰可以得到弥补。
由于负电荷分布的差异，PS骨架相比于PO骨架亲脂性较高。这种特性使得PS修饰的ASO更好地与血浆蛋白结合，减少了ASO的肾脏排泄；同时也增加了细胞对ASO的摄取。
值得注意的是，硫代修饰后，形成了P手性中心，因此硫代修饰的ASO存在多个异构体；但目前仍没有确切的临床证据表明，硫代修饰ASO的异构体在药物作用或副作用上表现出差异。
PMO修饰增强了ASO的核酸酶抗性，却不影响ASO对靶标RNA的结合。但是PMOs在生理pH下呈中性，难以与蛋白结合，容易被肾脏代谢，意味着它需要更高的药物剂量。
PNA是一种非天然的核酸类似物，由重复的N-（2氨基乙基）甘氨酸单元组成，酰胺键取代了DNA分子的磷酸二酯键骨架，碱基则通过亚甲基羰基连接在甘氨酸的氮原子上。
由于是人工合成的产物，PNA可以抵抗核酸酶和蛋白酶的降解；PNA与DNA或RNA的杂交遵循碱基互补配对原则，并且杂交活性几乎不受盐浓度影响。与DNA或RNA不同，PNA骨架几乎不带电荷，使得PNA与DNA或RNA结合时并不受静电排斥力；因此PNA-DNA或PNA-RNA杂交双链比天然的DNA双链、RNA双链或DNA-RNA杂交双链都更稳定。
2. 核糖修饰
微小的改变可以发挥巨大的作用，DNA与RNA之间的差别也仅在与核糖2'位的羟基。ASO序列中进行核糖修饰可影响ASO对RNA的亲和力、酶抗性，以及ASO与靶标RNA结合后的生物活性。目前ASO中常用的2'位修饰有2'-MOE、2'-OMe。许多基于2'位修饰的研究表明2'-MOE极大地延长ASO的半衰期，减少免疫原性，提升了ASO的效力，是一个强有力的修饰。
除了上述提到的修饰，ASO中常见的核糖修饰还有LNA(锁核酸)和cEt(受约束的乙基)修饰。
ASO发挥作用的机制
ASO发挥作用的机制可以分为两大类：结合介导的降解和结合引起的干扰。
RNase-H介导的水解是目前研究最深入的机制。RNase-H可识别DNA-RNA杂交双链并导致靶标RNA水解。研究表明ASO-RNA复合物要作为RNase-H的底物，ASO中至少需要5个连续的脱氧核苷酸基团，在具有8~10个脱氧核苷酸时，酶活性达到最佳。因此ASO利用RNase-H降解RNA时，通常具有一个8~10个脱氧核苷酸组成的中心区域，两侧则是2'修饰的核苷酸。
另外也有研究表明，ASO有不依赖于RNase H的mRNA降解途径。
除了降解靶标mRNA外，ASO可以利用空间占位对mRNA进行调控。在这类机制中，ASO不需要RNase-H起作用，而需要ASO与靶标RNA之间较高的亲和力。ASO利用空间占位机制发挥作用大致可细分为以下几个机制：
1. 阻断mRNA翻译。mRNA需要经过翻译才能表达为蛋白发挥功能。ASO通过与mRNA结合，翻译相关蛋白对mRNA的识别或结合，阻断mRNA的翻译，从而降低基因表达。
2. 切除mRNA 5'端帽子结构。有文章报道利用ASO裂解mRNA的帽子结构，抑制mRNA的翻译。
3. 调节mRNA多聚腺苷酸化位点。ASO也可通过与前体mRNA的多聚腺苷酸化位点结合，影响mRNA多聚腺苷酸化位点的选择，从而影响mRNA的稳定性。
4. 调控mRNA剪接。mRNA剪接需要剪接信号和相关蛋白的配合，是一个精细调控的过程，具有序列特异性。ASO通过与前体mRNA杂交，阻碍了剪接相关蛋白与前体mRNA结合，从而调控mRNA剪接。该策略的经典例子为已上市的ASO药物Nusinersen。
除了以上的机制，ASO也可通过与miRNA结合间接调控mRNA，或与mRNA上游的翻译调控元件结合，影响mRNA翻译。
图片来自Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases，图片展示ASO部分作用机制
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