揭示媒介蚊虫性别决定新机制

昆虫利用各种不同的起始信号激活性别决定通路，而通路下游基因doublesex（dsx）在各物种中却相对保守。模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，X染色体与常染色体的比值对胚胎的性别发育起决定性作用。两个X染色体共同激活Sex-lethal（Sxl）基因表达，产物触发一连串可变剪切事件，最终导致dsx和fruitless（fru）基因的雌性特异剪接和雌性发育特征的形成。在包括非果蝇科的蝇类和媒介蚊虫在内的一些双翅目物种中，性别决定的起始信号M因子（M factor）位于Y染色体或M locus上。几种媒介蚊虫的性别决定起始信号处于快速演变中，按蚊具有异态型性别染色体，冈比亚按蚊的M因子是位于Y染色体上的Yob基因，而斯氏阿蚊则是另一个Y染色体上的基因GuY1。而库蚊亚科蚊虫为同态性性别染色体，埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）M因子Nix位于1号染色体，是雄性正常发育必需的且足以将雌蚊转化为具有生殖能力的雄蚊。尽管骚扰阿蚊也属于库蚊亚科，但其基因组中却未发现Nix的同源基因。此外骚扰阿蚊M locus位于3号染色体，而具体的M因子和性别决定机制也仍不清楚。

为了筛选骚扰阿蚊的雄性决定基因，本研究对骚扰阿蚊雌蚊和雄蚊的基因组和各发育阶段转录组进行了测序和组装，运用染色体商法和基因发育表达谱筛选鉴定了15个雄性决定候选基因，最终通过雌蚊和雄蚊基因组PCR鉴定出1个雄性特异基因。选取胚胎和雄蚊RNA进行RACE实验克隆和鉴定了AsuMf的基因全长。表达谱结果显示AsuMf起始表达于性别尚未分化胚胎早期，其后持续至雄蚊的其他所有发育阶段。荧光原位杂交（FISH）结果显示AsuMf位于3号染色体，与骚扰阿蚊M locus位置相符（图1）。

图1. AsuMf是属于DBHS基因家族的雄性特异基因

（图源：Liu, et al., Nature communications, 2023）

为了研究AsuMf是否对雄性决定起作用，本研究通过设计AsuMf特异的sgRNA，运用CRISPR/Cas9对骚扰阿蚊胚胎AsuMf进行敲除，饲养至成蚊以后观察性别表型，结果显示在3次敲除实验中均观察到雄蚊产生了雌性化表型，主要表现为外生殖器缺失、缺失或畸形，触角上轮毛变短而稀疏，触须变短，内生殖其表现为出现精巢缺失、畸形、或发育为卵巢。基因组测序证实了雌性化雄蚊AsuMf-sgRNA位置的突变。以上结果表明AsuMf是骚扰阿蚊雄性发育必需的（图2）。

图2. AsuMf对骚扰阿蚊雄性正常发育是必需的

（图源：Liu, et al., Nature communications, 2023）

为进一步探讨AsuMf调控雄蚊性别决定的分子机制，本研究鉴定和克隆了性别决定通路下游基因Asudsx和Asufru。AsuMf 敲除蚊的Asudsx和Asufru可变剪接向雌性偏移，说明AsuMf在性别决定通路上游直接或间接调节Asudsx和Asufru的性别可变剪接。单只成蚊RNA-seq的表达谱结果显示AsuMf敲除导致大量female-biased基因上调，male-biased基因下调，表明AsuMf突变导致雄蚊转录组整体向雌性偏移（图3）。

图3. AsuMf 的敲除导致dsx、fru和其他sex-biased基因表达谱从雄性向雌性偏移

（图源：Liu, et al., Nature communications, 2023）

基因家族分析结果显示AsuMf与其旁系同源基因AsuHrp65均属于果蝇行为/人类剪接（DBHS）家族。DBHS基因家族在脊椎动物有三个旁系同源基因编码SFPQ（PSF，富含脯氨酸和谷氨酸的剪接因子基因）、NONO（p54nrb，非POU结构域含有的八聚体结合基因）和PSPC1（Paraspeckle组分1基因），而大多数无脊椎动物只有一个基因编码DBHS（图4）。DBHS基因在其他动物中尚未有性别决定功能的报导。基因共线性分析结果显示DBHS在这些物种基因组演化过程中染色体臂位置的同源性是一致的（图4），说明祖先基因AsuHrp65通过基因重复（gene duplication）产生了AsuMf。这种基因重复很可能发生在阿蚊属和伊蚊属分化之后。

图4. AsuMf来源于DBHS基因家族中一个基因的重复

（图源：Liu, et al., Nature communications, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究鉴定出一个骚扰阿蚊的雄性决定基因AsuMf，该基因具有M因子的两大基本特征：雄性特异和早期胚胎表达的特点。AsuMf位于第3号染色体上的基因组位置与骚扰阿蚊中的M locus一致。AsuMf可直接或间接调控dsx和fru的性别可变剪接，是雄蚊正常发育必需的。该研究进一步对AsuMf进行了基因家族和基因共线性分析，发现该基因来自于动物中普遍存在的DBHS基因家族基因Hrp65 的基因重复，并产生了性别决定的新功能。

本研究发现媒介蚊虫通过招募旁系同源基因新功能化产生雄性决定因子的现象，揭示了一种蚊虫性别决定基因(M factor)产生的新机制，为动物中性别决定顶端信号的进化提供了新的见解。这些例子展示了性别决定机制在昆虫中的多样性和复杂性，这些差异可能对于不同物种的生存和繁殖具有重要意义。深入了解这些性别决定机制不仅有助于我们更好地理解生物多样性，还将有助于对蚊媒传染病防控提供新的策略。