发现自我复制型RNA纳米疫苗可诱导针对SARS-CoV-2的特异性免疫保护反应

随着新型冠状病毒的全球大流行，mRNA疫苗因其独特的优势备受关注。mRNA可在体外无细胞条件下快速大规模合成；mRNA不会整合到宿主基因组，安全性高；一条mRNA分子可以同时表达多个抗原或目的蛋白，从而提供多种免疫原接种或同时整合免疫调节分子。然而传统mRNA的表达时间较短，免疫原性有限，因此需要提高mRNA剂量或进行多次注射才能诱导有效的免疫反应。自我复制型RNA（Self-replicating RNA, repRNA）是一种衍生于甲病毒基因组、经基因工程改造的mRNA。它可在细胞质中完成自我复制，以较低的剂量即可诱发目的蛋白的长时间、高效率表达。

研究者基于自我复制型RNA技术以新冠病毒刺突蛋白（Spike）的RBD结构域为抗原，开发出了使用脂质体-鱼精蛋白配方（Liposome-Protamine-RNA, LPR）为递送载体的纳米疫苗（LPR-repRNA-RBD）。该疫苗可将repRNA-RBD递送至引流淋巴结，促进RBD抗原在引流淋巴结长效表达，同时高效激活先天免疫信号通路，进而诱导抗原特异性细胞免疫反应与体液免疫反应，并抑制SARS-CoV-2在小鼠肺组织的感染及其引发的炎症损伤。

为了探究LPR-repRNA纳米疫苗的体内递送效率，研究者将LPR-repRNA-RBD皮下注射免疫C57BL6小鼠，ELISA结果显示LPR可将repRNA-RBD有效递送至引流淋巴结（dLN）；此外，与传统mRNA相比较，repRNA不仅显著延长RBD在dLN中表达时间（至少14天），而且显著增强RBD的表达量。研究者使用P2A linker将RBD与GFP相连接，流式细胞术结果显示LPR-repRNA纳米疫苗可被dLN中DC细胞、抗原交叉呈递细胞（CD103⁺DC）、巨噬细胞与B细胞等具有抗原提呈功能的细胞有效摄取并完成抗原表达。

图1. LPR-repRNA纳米疫苗的体内递送效率

（图源：Li et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2023）

由于在基因表达载体中保留了来源于甲病毒的非结构蛋白域，repRNA相比mRNA具备更强的自佐剂效应和免疫原性，进而可以高效地激活多条先天免疫信号通路。研究者发现，LPR-repRNA纳米疫苗可在体外激活巨噬细胞来源的I型干扰素（IFN-I）报告基因细胞系。体内研究结果显示，相较于LPR-mRNA-RBD，LPR-repRNA-RBD可以更有效地提高Rsad2、IFN-β、STAT1、STAT2、IRF9、IRF3、MDA5、RIG-1、IL-6等与先天免疫信号通路相关的基因的转录水平。研究者还发现，LPR-repRNA-RBD可以提高dLN中pDC细胞数量并增强CD103⁺DC细胞表面共刺激分子（CD80/CD86）的表达，这些结果表明LPR-repRNA-RBD可以高效激活dLN中的先天免疫信号通路，促进IFN-I的表达，并诱导DC、pDC、CD103⁺DC、巨噬细胞和B细胞向dLN浸润，从而增强疫苗的抗原提呈能力和先天免疫反应。

图2. LPR-repRNA纳米疫苗激活先天免疫反应

（图源：Lin et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2023）

接下来，研究者分析LPR-repRNA纳米疫苗诱导的细胞免疫反应。分别在第0天和第28天免疫C57BL/6小鼠，加强免疫一周后收集小鼠外周血并使用RBD多肽库刺激。胞内细胞因子染色结果显示，与LPR-mRNA-RBD相比较，LPR-repRNA-RBD可显著上调外周血中CD4⁺ T细胞与CD8⁺ T细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-2与Ki67的表达，这些结果表明，LPR-repRNA-RBD可以诱导产生更多的抗原特异性T细胞，并增强T细胞的增殖。此外，LPR-repRNA-RBD可以诱导CD8⁺ T细胞向记忆效应T细胞方向分化，从而提供长期的免疫保护作用。

图3. LPR-repRNA纳米疫苗诱导细胞免疫反应

（图源：Lin et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2023）

进一步，研究者评估LPR-repRNA纳米疫苗诱导的体液免疫反应。分别在第0天和第28天免疫C57BL/6小鼠，并在第14天和第35天收集小鼠血清。ELISA结果显示，与LPR-mRNA-RBD相比较，LPR-repRNA-RBD诱导产生更高滴度的Anti-RBD IgG；LPR-mRNA-RBD与LPR-repRNA-RBD的免疫均诱导产生偏向于Th1类型的免疫反应。此外，SARS-CoV-2假病毒中和实验结果显示，与LPR-mRNA-RBD相比较，LPR-repRNA-RBD免疫的小鼠血清具有更高的中和抗体滴度以及更强的中和作用。

图4. LPR-repRNA纳米疫苗诱导体液免疫反应

（图源：Lin et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2023）

最后，研究者分析LPR-repRNA纳米疫苗的保护效率。C57BL/6小鼠经过两次免疫后鼻滴Ad5-hACE2，5天后通过鼻滴感染SARS-CoV-2。结果显示，LPR-repRNA-RBD组显著降低了小鼠肺组织中SARS-CoV-2 N基因和ORF1ab基因的拷贝数，并减少了病毒的负载量。此外，研究者还发现，在LPR-repRNA-RBD组的小鼠肺组织中，SARS-CoV-2 E基因亚基因组mRNA（Esg）水平显著下调，这表明LPR-repRNA-RBD组的病毒复制能力减弱。研究者进一步分析了小鼠肺部的炎症反应情况，结果显示，与对照组相比，LPR-repRNA-RBD组的小鼠肺组织中，与炎症相关的基因IL-6和IL-1β的转录水平显著下调；同时，肺部受到SARS-CoV-2感染导致的肺上皮组织变性、炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚、肺泡空间塌陷和间质水肿等病理损伤情况得到了明显改善。

图5. LPR-repRNA纳米疫苗在SARS-CoV-2感染中的保护作用

（图源：Lin et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究基于自我复制型RNA技术编码SARS-CoV-2 RBD，应用脂质体-鱼精蛋白递送系统开发了LPR-repRNA-RBD纳米疫苗。该疫苗能够在引流淋巴结中长时间表达RBD抗原，促进引流淋巴结的先天免疫反应和免疫细胞的浸润，从而激发抗原特异性的细胞免疫反应和体液免疫反应，为小鼠提供在SARS-CoV-2感染过程中的保护作用。该研究也存在一些不足之处，比如与Spike蛋白全长相比较，RBD结构域的免疫表位相对较少，导致其诱导的免疫保护作用相对较弱。此外，LPR系统的递送效率还有进一步改善的空间。研究者将在后续的研究中针对上述问题进行深入探究，以开发更为理想的新冠病毒RNA纳米疫苗。