18101298214
发布日期:2023/8/24 18:22:00
磷酸盐(phosphate,Pi)稳态在所有生物体中都是一个受严格调控的过程,其功能障碍会导致人类肾范可尼综合征、植物生长迟缓和微生物致死等多种功能紊乱。为了在Pi的生物合成需求和胞质Pi浓度过高的风险之间实现平衡,细胞以无机多聚磷酸盐(polyphosphate,polyP)的形式将Pi储存在膜结合的酸钙小体样细胞器中。酿酒酵母液泡转运蛋白伴侣(vacuolar transporter chaperone,VTC)复合体作为唯一已知的真核生物多聚磷酸盐聚合酶,利用ATP在胞质中合成polyP,并将其转运到液泡中储存起来以维持细胞内Pi稳态。
 
酿酒酵母VTC复合体包含了至少四个亚基:Vtc1、Vtc2、Vtc3和Vtc4,同源蛋白在其他低等生物中也已经被发现。近年来,随着VTC复合体的聚合酶和转位酶功能被鉴定,polyP合成和转运的偶联机制也被确定。虽然目前已经获得了一些结构域的结构,但是有限的信息限制了研究人员对生理状态下VTC复合体的组装,调控以及激活机制的研究。
解析了酿酒酵母内源性完整的VTC复合物的冷冻电镜结构,结合一系列体内和体外的功能数据,对polyP通道的门控机制和VTC激活机制提出了新的见解。
 
 
首先,研究人员对生理状态下的VTC复合体的组装方式进行了研究。Vtc4/Vtc3/Vtc1复合体的结构揭示了一个意想不到的异源五聚体结构,包含一个Vtc4亚基,一个Vtc3亚基和三个Vtc1亚基(图1)。每个亚基的三次跨膜螺旋(TM1-TM3)以赝对称的方式组装,形成圆柱形五聚体跨膜结构域(图1)。Vtc3的胞质结构域和Vtc4的胞质结构域形成非对称的异源二聚体。在Vtc4的中心结构域中包含三磷酸盐和Mn2+这或许与我们的内源性表达有关。
 
图1 VTC复合体的结构(A)和跨膜区组装(B)
(图源:Liu W, et al., EMBO J, 2023)
 
随后,作者深入探究了VTC复合体的功能。VTC的结构和体外polyP合成实验都清晰的支持VTC偶联polyP聚合酶和转位酶活性。作者利用纯化的液泡和5-InsP7以及1,5-InsP8等生理性配体对VTC的功能展开了研究,发现纯化的VTC复合体以ATP-和肌醇多聚磷酸盐(PP-InsPs)依赖的方式合成polyP(图2)。VTC复合体的跨膜区形成一个polyP选择性通道,可能采用静息态构象,其中Vtc4的闩锁状水平螺旋(HH)限制了polyP的进入(图2)Vtc4的催化中心结构域位于赝对称polyP通道的顶部,为新合成的polyP创造了一个强正电性通路,该通路可以偶联polyP的合成和转运。
 
图2 VTC复合体的功能研究
(A)分离的液泡合成polyP。(B)Vtc4的水平螺旋HH堵塞polyP通道的入口。(C)Vtc3的结构域组成。(D)Vtc3通过磷酸化的loop的调控polyP的合成。
(图源:Liu W, et al., EMBO J, 2023)
 
进一步,作者探究了VTC复合体调控polyP的合成。Vtc3和Vtc4都包含一个高度相似的SPX结构域,该结构域已经被证实能够与含磷酸盐的配体发生相互作用。研究发现只有Vtc4的SPX结构域对于polyP的合成和PP-InsPs调控是至关重要的。进一步,作者还发现Vtc3通过磷酸化的loop来调控polyP的合成。Vtc3存在一段特殊的loop(残基234-292),该loop的C-端包含一簇磷酸化位点,作者利用丙氨酸或天冬氨酸取代该loop中六个丝氨酸残基来模拟非磷酸化或磷酸化状态,实验结果暗示该loop的磷酸化对polyP的合成具有负调节作用(图2)。
 
最后,作者探究了polyP通道的门控机制研究发现Vtc4的水平螺旋在通道入口处的不对称排列对polyP通道施加了不对称的力,导致亚基间相互作用界面的相对位置不同,使得由TM1螺旋形成的通道直径从胞质侧向液泡内侧逐渐变窄,形成一个可能用作门控的最窄点。亚基间多对保守的盐桥形成的“离子锁”可以将各亚基维持在一起。因此,在polyP通道打开期间,水平螺旋闩锁可能被抬起,TM1螺旋可能在胞质侧向内倾斜,在液泡侧向外倾斜,从而完成通道的开放(图3)。基于结构分析和功能数据,作者提出了一个简化的VTC激活机制模型。
 
图3 PolyP通道的门控机制
(A)VTC复合体的亚基间界面形成多对保守的盐桥。(B)PolyP通道的门控机制模型。(C)VTC复合体的分子机制模型。
(图源:Liu W, et al., EMBO J, 2023)
 
文章结论与讨论,启发与展望

综上,本文解析了内源性完整的Vtc4/Vtc3/Vtc1复合体的结构,该结构揭示了一个意想不到的异源五聚体结构,包含一个Vtc4亚基、一个Vtc3亚基和三个Vtc1亚基。VTC复合体的结构和体外polyP合成实验都支持VTC偶联polyP的合成和转运机制。研究发现只有Vtc4的SPX结构域调控polyP的合成,而非催化的Vtc3通过磷酸化的loop调控VTC。基于观测到的polyP通道处于静息和紧锁状态以及亚基间多对保守的盐桥形成的“离子锁”,本文提出了polyP通道的门控机制。但是,由于缺乏polyP转运通道开放构象的结构,使得无法验证推测的门控机制的准确性。在本研究中作者发现VTC复合体偶联polyP的合成和转运,而且VTC复合体以ATP-和肌醇多聚磷酸盐依赖的方式合成polyP。因此,在后续的研究中,或许可以通过在PP-InsPs等配体的刺激作用下来获得polyP通道开放构象的结构。

上一篇:发展红外光谱微生物分型新方法 下一篇:解析METTL16驱动白血病发生的机制
已经到最底了
服务支持
新闻资讯
关于我们
微信扫一扫