高成功率建立乳腺癌原代细胞系

乳腺癌是全球发病人数最多的癌症，严重危害女性的健康。根据最新的统计结果，2020年全球乳腺癌发病人数是226万，比2018年诊断的乳腺癌患者208.8万增加18万人，提示在全球范围内乳腺癌发病率急剧升高。新辅助治疗是指乳腺癌患者在接受手术治疗前接受全身药物治疗。这种治疗方案的目的是缩小肿瘤的体积或减少肿瘤的扩散，将不可手术的乳腺癌降期为可手术的乳腺癌，增加保留乳房或者腋窝手术的机会，获得乳腺癌患者对药物敏感性的相关信息，从而指导后续治疗以期改善患者的预后。新辅助化疗是绝大部分乳腺癌，尤其是局部晚期乳腺癌的标准治疗方法。不过，在全世界范围内仅有12-28%患者可以达到病理完全缓解。10-35%患者对新辅助化疗药物不敏感，甚至5%患者新辅助化疗后病灶出现进展。因此，建立可以预测乳腺癌患者对新辅助化疗药物敏感性的技术手段，可以精准选择适合患者的治疗方案，提高治疗效果，同时避免对化疗药物耐药患者的治疗时间延误和减少不必要的药物副作用危害。

现阶段缺乏可靠和有效预测乳腺癌对化疗药物敏感的技术。在基因表达谱层面，对于乳腺癌，基因检测可以用于指导乳腺癌患者的靶向、免疫用药、遗传筛查及复发转移的风险评估，但在评估乳腺癌对化疗药物的敏感性方面还不成熟。病理检测层面，通过检测雌激素受体ER，HER2和KI-67预测乳腺癌患者对化疗药物的治疗效果。不过，这些检测手段还不能可靠的预测乳腺癌患者对化疗药物的敏感性。探索性研究包括整个乳腺癌组织细胞培养预测乳腺癌对化疗药物的反应[1]，建立类器官（Organoid）培养平台和PDX动物模型预测乳腺癌患者对化疗药物的反应[2]。这些从不同角度和不同层面预测乳腺癌患者对化疗药物反应的技术，由于成功率低，费用昂贵，检测周期长和准确率低等诸多问题限制了临床应用。

乳腺癌原代细胞培养为预测新辅助化疗药物疗效提供了新的技术手段。近期麻省总院的医学科学家从乳腺癌组织制备乳腺癌原代细胞，建立乳腺癌原代细胞系，用于筛选个体化有效药物。不过建立乳腺癌原代细胞系成功率为15%，培养基中加入表皮生长因子和胰岛素，培养体系加入放射的纤维母细胞等因素限制了其临床应用预测化疗药物敏感性[3]。建立乳腺癌原代细胞系是当前研究的瓶颈问题。由乳腺外科，病理科和临床医学研究中心组成的乳腺癌研究团队成功建立了乳腺癌原代细胞系培养体系，从18例患者的乳腺癌组织成功建立了14株乳腺癌原代细胞系，成功率达到77%，突破了乳腺癌原代细胞系培养成功率低的瓶颈问题，为预测乳腺癌对化疗药物敏感性提供了新的平台。该研究团队发现乳腺癌耐药细胞株BC3#对蒽环类药物吡柔比星耐药水平较敏感细胞株BC4#高出24倍，乳腺癌耐药细胞株BC3#对蒽环类药物多柔比星耐药水平较敏感细胞株BC5#高出369倍，提示培养的乳腺癌原代细胞系对化疗药物耐药性差别显著。综上，该团队建立了培养乳腺癌原代细胞系的培养体系，高成功率从乳腺癌组织分离了乳腺癌原代细胞系，在细胞水平建立了预测乳腺癌对化疗药物反应的检测平台，为筛选乳腺癌患者的个体化精准治疗的化疗药物用药提供新的技术手段。

该团队在培养鼠乳腺干细胞的基础上[4]，建立了培养乳腺癌原代细胞系的培养基BCMI。18例乳腺癌组织样本(包括穿刺样本和新辅助化疗后的手术切除样本)成功培养了14株乳腺癌原代细胞系，成功率达到了77%。该研究突破乳腺癌原代细胞系培养成功率低的瓶颈问题，为筛选适合个体化精准治疗的化疗药物提供了新的平台。该团队检测了乳腺癌原代细胞系的病理分子标志物，分析了培养的乳腺癌原代细胞系和乳腺癌来源的一致性。检测了乳腺癌原代细胞系短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR），确定了乳腺癌原代细胞系的遗传标记。该研究发现5000个甚至更少的乳腺癌原代细胞系可以在裸鼠乳腺脂肪垫形成肿瘤，而传统的人乳腺癌细胞系，比如MCF-7，需要100万个细胞才能在裸鼠体内形成肿瘤，说明我们建立的乳腺癌原代细胞系在生物学功能上和传统的乳腺癌细胞系差异很大。综上，我们建立的乳腺癌原代细胞系为研究乳腺癌发病机制，药物研发和临床药物筛选提供了新的平台。

图1 我们建立的6种乳腺癌原代细胞系形态。

该研究分析了6种乳腺癌原代细胞系对化疗药物的敏感性。通过CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 实验(Promega, USA)，我们发现耐药的乳腺癌原代细胞株BC3#对化疗药物吡柔比星的IC50（半数抑制浓度）是敏感的乳腺癌原代细胞株BC4#的24倍，说明细胞株BC3#对吡柔比星耐药能力是细胞株BC4#的24倍。对吡柔比星耐药的乳腺癌原代细胞系依次是BC3#，BC6#，BC10#，BC13#，BC5#和BC4#。同样的，我们通过CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 试剂盒发现耐药的乳腺癌原代细胞株BC3#对蒽环类药物多柔比星IC50是敏感的乳腺癌原代细胞株BC5#的369倍，说明细胞株BC3#对多柔比星耐药能力是细胞株BC5#的369倍。对多柔比星耐药的乳腺癌原代细胞系依次是BC3#， BC6#，BC10#，BC13#，BC4#和BC5#。6种乳腺癌原代细胞株对化疗药物敏感性差别显著，提示我们建立的乳腺癌原代细胞培养体系可能用于预测乳腺癌患者对化疗药物的反应。

图2 6种乳腺癌原代细胞株对吡柔比星耐药检测。

图3 6种乳腺癌原代细胞株对多柔比星耐药检测。

文章结论与讨论，启发与展望

我们通过18例乳腺癌组织样本成功培养了14例乳腺癌原代细胞系，成功率达77%。该研究突破了乳腺癌原代细胞系培养的瓶颈问题，为筛选个体化治疗的化疗药物提供了新的平台。通过6种建立的乳腺癌原代细胞系耐药分析，发现不同的乳腺癌原代细胞系对吡柔比星和多柔比星耐药存在显著差别，提示我们建立的乳腺癌原代细胞系可能用于检测乳腺癌患者对化疗药物的耐药。如何优化培养基和培养程序，减少建立细胞系的周期，提高乳腺癌原代细胞系培养成功率，是我们下一步研究的重点。通过比对乳腺癌原代细胞系对化疗药物的敏感性和临床乳腺癌患者对药物的耐药，建立一个可信的筛选个体化化疗药物治疗的平台，是我们下一步研究的方向。我们发现5000个甚至更少的乳腺癌原代细胞系可以体内形成肿瘤，而传统的人乳腺癌细胞系需要100万个细胞才能在体内形成肿瘤，说明我们建立的乳腺癌原代细胞系在生物学功能上和传统的乳腺癌细胞系差异很大，为研究乳腺癌发病机制和药物研发提供新的工具。