揭示环状RBA circHIPK3 通过抑制自噬相关铁死亡促进胃癌顺铂耐药新机制

胃癌(gastric cancer, GC )是最常见的消化系统肿瘤之一。GC患者临床症状隐匿，通常与诊断晚和预后差有关（PMID: 33538338）。临床上GC患者的传统疗法包括手术切除和辅助化疗（PMID: 23966224）。目前，基于顺铂的化疗已成为晚期胃癌患者的主要治疗方案（PMID: 27156933）。然而，由于表观遗传学修饰、信号通路改变和细胞代谢紊乱，大多数GC患者不可避免地对顺铂产生耐药性（PMID: 19153121）。因此，有必要阐明这种潜在的顺铂耐药机制，以改善GC患者的临床预后。

环状RNAs（circRNAs）是一类新的非编码RNAs（ncRNAs），它们具有高度保守的共价闭环结构，起源于前信使核糖核酸的差异反向剪接（PMID: 32019587）。越来越多的证据表明，异常circRNAs在肿瘤发生和化疗抵抗中发挥重要作用（PMID: 28535767）。最近研究报道，circHIPK3异常升高导致了结直肠癌、胰腺癌和乳腺癌在内的多种化疗药物抵抗（PMID: 31631038，PMID: 32104074，PMID: 34285578）。然而，我们仍不清楚circHIPK3促进GC产生顺铂耐药性的具体分子。

巨自噬（以下简称自噬, autophagy）是一种进化上保守的分解代谢降解过程，并以依赖环境的方式诱导细胞死亡或促进细胞存活（PMID: 23817233）。铁死亡(ferroptosis)被定义为一种与细胞凋亡、坏死和自噬不同的铁依赖性癌细胞死亡形式PMID: 33514910。有趣的是，自噬体的积累，特别是自噬成分有助于细胞铁死亡，如BECN1 介导的系统 x c -抑制、STAT3 诱导的溶酶体膜透化、RAB7A 依赖的脂肪吞噬以及NCOA4 促进的铁蛋白吞噬等（PMID: 30880243）。先前的研究表明多种circRNAs可调节自噬和铁死亡进程导致顺铂耐药（PMID: 33153478，PMID: 33198772，PMID: 33234130），但由于不同的癌种和疾病阶段自噬可能发挥不同的作用。GC中自噬依赖性铁死亡与耐药性之间的联系仍然存在争议。因此，了解自噬依赖性脱铁症的分子机制可能有助于开发新的抗癌疗法。

该研究揭示了circHIPK3通过靶向自噬和铁死亡调节顺铂耐药性，机制方面，敲低circHIPK3通过miR-508-3p/Bcl-2/beclin1/SLC7A11轴增强诱导自噬依赖性铁死亡，进而提高GC细胞对顺铂的敏感性。这为克服顺铂治疗抵抗提供了新策略。

为了探究circHIPK3对于GC顺铂耐药的影响，研究团队首先通过RT-qPCR分析发现circHIPK3在顺铂耐药GC肿瘤组织和细胞（AGS/DDP, HGC‐27/DDP和MKN‐28/DDP）中显著高表达（图1a）。细胞功能实验表明，circHIPK3的过表达增加了顺铂治疗下AGS/DDP和HGC‐27/DDP细胞的生存能力，而敲减circHIPK3则限制抑制了相同顺铂处理下GC/DDP细胞的增殖能力（图1b-f）。为了进一步评价circHIPK3在体内的生物学功能，将过表达circHIPK3和circHIPK3敲低细胞的细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。随后，顺铂（6 mg/kg）每周三次腹膜内注射到小鼠中，结果表明GC/DDP细胞中circHIPK3的沉默抑制了异种移植物肿瘤的重量和生长，并增强了GC中顺铂治疗的效果（图1g−k），而circHIPK3过表达表现出相反的效果。这些结果表明，circHIPK3对于GC顺铂耐药中具有重要作用。

图1 CircHIPK3在体内和体外均对GC顺铂耐药性有贡献。

细胞凋亡和自噬是化疗耐药的关键因素。为此，研究团队通过流式细胞术分析发现circHIPK3过表达显著抑制细胞凋亡。相反，下调circHIPK3增强了GC/DDP细胞凋亡（图2a）。同样，TUNEL实验也发现一致的现象（图2b）。此外，作者利用3-甲基腺嘌呤(3-MA, 一种自噬抑制剂)与细胞共培养并通过westernblot检测自噬相关标志物，发现在上调circHIPK3后，GC/DDP细胞中的beclin1和LC3-II水平降低，但自噬底物蛋白p62的表达增加。而敲减circHIPK3则表型相反（图2d）。自噬流量的抑制和都可导致LC3‐II的积累。为了证明这种假设，作者使用报告基因mRFP-GFP-LC3系统监测GC/DDP细胞中的自噬流量。过表达circHIPK3减少了LC3的积累，而沉默circHIPK3则导致相反的结果（图2e）。值得注意的是，当3‐MA与circHIPK3敲减的的细胞共培养时，我们观察到3‐MA消除了基本的自噬过程，并逆转了circHIPK3抑制诱导的化学增敏（图2c−e）。这些数据提示，circHIPK3通过限制GC/DDP细胞的自噬激活增强顺铂耐药性。

图2 CircHIPK3通过减弱AGS/DDP细胞中的自噬激活来增强顺铂耐药性。

研究发现，铁死亡在肿瘤的化疗抵抗中发挥着重要作用。作者分析发现，与亲本GC细胞相比，GC/DDP细胞中检测到ROS、MDA和Fe2+水平降低，同时GSH水平升高。在联合爱拉斯汀(Erastin)和顺铂的共培养中，细胞活力进一步降低。且亲代细胞和GC/DDP细胞的细胞活力下降程度存在差异。为了进一步探究circHIPK3与铁死亡之间的相关性。作者使用铁死亡诱导剂Erastin和索拉非尼(Sorafenib)处理GC/DDP细胞，过表达circHIPK3不仅抑制了细胞的增殖能力（图3a和b），还显著减少了脂质ROS生成、GSH耗竭和氧化还原活性铁（Fe²⁺）以及MDA产生（图3c和d）。同时，研究团队观察到circHIPK3的上调增强了GPX4和SLC7A11的蛋白表达（图3e和f）。TEM分析显示，空载体细胞组表现出典型的脱铁性形态变化，包括线粒体萎缩和嵴减少，而circHIPK3过表达消除了这些特征（图3g）。另一方面，作者联用铁死亡抑制剂ferrostatin‐1发现进一步增强了细胞细胞的增增殖能力。这些结果表明铁死亡在circHIPK3介导的顺铂耐药性中的具有重要作用。

图3 过表达circHIPK3阻断GC/DDP细胞中的铁死亡。

大量研究报道circRNA可以作为miRNA的海绵。研究团队通过FISH和RT-qPCR实验发现，circHIPK3优先富集在细胞质中（图4a和b）。鉴于此，研究者基于starBase, circBank, 和circRNA interactome数据库预测了两个潜在的miRNAs（miR‐508‐3p和miR‐338‐3p）（图4c）。发现在依赖于circHIPK3表达的GC/DDP细胞中，只有miR‐508‐3p的水平发生了改变（图4d）。进一步地，在GC/DDP细胞中，同样检测到miR‐508‐3p表达水平下降（图4e）。为了证明circHIPK3与miR‐508‐3p的结合关系，作者基于预测的结合位点构建了circHIPK3 wt和circHIPK3‐Mut荧光素酶报告质粒。结果表明，在与miR‐508‐3p模拟物和circHIPK3‐WT质粒共转染的细胞中，萤光素酶活性明显降低（图4f）。此外，将特异性靶向circHIPK3的生物素标记探针应用于RNA下拉，并在过表达circHIPK3的GC/DDP细胞中验证了下拉效率（图4g）。结果显示，与对照组相比，circHIPK3探针大量下调了miR‐508‐3p（图4h）。miRNA下拉分析进一步证明，生物素化的miR‐508‐3p模拟物可以从GC/DDP细胞中大量捕获circHIPK3（图4i）。

图4 CircHIPK3是miR‐508‐3p的海绵。

先前的研究已经证明了BECN1可通过抑制系统Xc−活性来调节铁死亡（PMID: 30145930）。因此，作者利用BECN1质粒用于激活自噬。在存在circHIPK3过表达的情况下，BECN1质粒转染恢复了自噬体的产生和自噬流量（图5a）。事实上，Erastin和Sorafenib诱导的生长抑制被circHIPK3的过表达所挽救，而BECN1质粒显著抑制了GC/DDP细胞的生长（图5b）。类似地，在用Erastin和Sorafenib处理的GC/DDP细胞中，circHIPK3的过表达消除了Fe2+积累、MDA产生、GSH耗竭和脂质ROS浓度（图5c）。相反，在BECN1质粒存在的情况下，circHIPK3的过表达并不能显著抑制铁死亡（图5c）。此外，circHIPK3的上调增强了SLC7A11和GPX4的水平，而BECN1质粒逆转了这种作用（图5d和）。总之，这些发现证实了BECN1质粒对自噬的激活逆转了circHIPK3过表达诱导的铁死亡抑制。

图5 CircHIPK3通过beclin1/SLC7A11复合物在AGS/DDP细胞中调节铁死亡

图6 CircHIPK3通过阻断自噬依赖性脱铁作用，促进癌症对顺铂的耐药性。

文章结论与讨论，启发与展望

本研究从GC患者易产生顺铂耐药性这一临床问题入手，发现circHIPK3可通过miR‐508‐3p/Bcl‐2/beclin1/SLC7A11轴抑制自噬依赖性铁死亡，进而增强GC/DDP细胞对顺铂的耐药性，并发现外泌体circHIPK3在顺铂耐药GC患者血清中的表达增加。但由于样本量限制，该研究所发现的作为潜在的顺铂耐药监测标志物需要在更多的患者人群中进行深入验证。综上，靶向circHIPK3可能成为改善GC患者顺铂耐药性的潜在靶点（图6）。