炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）包括Crohn’s disease（CD）和Ulcerative colitis（UC），是胃肠道最常见的慢性炎症性疾病[1]。我国IBD的发病率近几十年急剧增加，如不进行早期诊断和治疗，极易增加抑郁症、结直肠癌甚至死亡的风险。传统的诊断方式依赖于肠镜等侵入式的检测方法，对患者造成极大的痛苦，更重要的是难以实现早期诊断。此外，难以精确控制用药剂量，导致药物摄入不足或过量。基于合成生物学的智能基因工程细菌的发展为疾病的在体诊疗研究提供了新的契机及独特的解决方案[2]。然而，目前关于如何设计和构建多功能的智能工程菌并将其应用于疾病诊断，记录以及治疗的实验方案仍缺乏系统性阐述。

在该方案中，作者首先详细阐述了设计和构建一株多功能智能益生菌i-ROBOT的方法。α-溶血素分泌系统以及分子记录靶标通过λ-同源重组等技术插入益生性大肠杆菌Nissle 1917基因组中。炎症标志物硫代硫酸盐传感元件，记录元件以及功能元件等通过同源重组的方式构建在低拷贝质粒载体中，并通过电转将重组质粒转入基因组插入的工程菌中。以此方法构建的工程菌包含三个关键模块（荧光报告、碱基编辑系统和药物分泌），分别用于诊断、记录和改善小鼠炎症性肠病。

图1 基因工程菌的构建及其诊断、记录和改善小鼠炎症性肠病的实验方案

作者随后详细描述了如何利用i-ROBOT检测，记录和改善小鼠炎症性肠病。使用3% DSS诱导小鼠结肠炎，将活化后的工程菌通过口服灌胃的方式给予处于不同结肠炎时期的小鼠。一段时间后，收集小鼠粪便及结肠内容物并分离菌群。用预冷的PBS清洗后，将部分样品在含有高浓度氯霉素的PBS中重悬，并在37℃, 1000 rpm的微孔板摇床中活化2小时促使荧光蛋白成熟，随后使用流式细胞仪分析菌群中基因工程菌的荧光强度，以此评估工程菌诊断小鼠炎症性肠病的能力。另将一部分菌群样本适当稀释于含相应抗生素新鲜的LB培养基中过夜培养，使用测序引物对培养物进行PCR后测序，通过MATLAB程序:Sequalizer [4]分析测序峰图以量化碱基编辑率。同时将培养物连续稀释后涂布于含有X-Gal的平板中继续培养，长出单克隆后计算蓝色与白色克隆的比例，以此评估工程菌记录小鼠炎症性肠病的能力。

图2 i-ROBOT诊断和记录小鼠炎症性肠病

最后，使用3%DSS诱导小鼠结肠炎，将活化后的工程菌以每日口服灌胃的方式给予小鼠，通过疾病活性评分，体重，结肠长度，结肠组织切片以及炎症因子水平等指标评估i-ROBOT对小鼠结肠炎的改善作用。

图3 i-ROBOT改善小鼠炎症性肠病