通过培育转基因小鼠探索Stat3基因在间充质细胞分化发育为牙体硬组织过程中的作用及其可能的内在机制

信号转导和转录活化因子3（Signal transducer and activator of transcription 3, Stat3）是在多种细胞中普遍表达的细胞质转录因子，人类Stat3基因缺陷会导致常染色体显性高IgE综合征（Autosomal dominant hyper-IgE syndrome, AD-HIES）。AD-HIES患者除了严重免疫缺陷外，还表现出骨骼和牙齿异常，在牙齿方面表现为恒牙萌出延迟、牙列紊乱等。虽然近些年来Stat3在维持骨稳态和促进骨发育中的作用被不断揭示，但是Stat3导致AD-HIES 患者的牙齿发育异常的具体机制仍然不清晰。牙齿发育缺陷会影响人们日常生活中正常的咀嚼和言语功能，甚至影响容貌，造成心理疾病。因此，研究牙齿发育缺陷的致病基因具有重要的临床意义。

该研究采用Cre-loxP系统培育牙源性间充质细胞中条件性敲除Stat3基因的转基因小鼠（Stat3 conditional knockout, Stat3 CKO），探究Stat3在牙齿发育中的作用并对其机制进行初步探索，证实Stat3在牙齿硬组织生长发育中起着重要的调控作用，为基因缺陷引起的牙齿发育障碍提供诊疗依据和治疗思路。

牙齿为人体的矿化器官之一，具有与骨骼相似的组成成分和形成机制，并在发育和矿化过程中受到许多相同基因和激素的调节。一些相关因子的异常表达导致牙齿出现与骨骼相似的发育缺陷。在小鼠成骨细胞中条件性敲除Stat3基因可导致小鼠出现一系列与AD-HIES患者相关的骨骼畸形，提示Stat3在骨发育中发挥着重要作用。然而，Stat3在牙齿硬组织发育中的作用尚不清楚。为了探讨Stat3基因突变对间充质细胞介导的牙发育的影响，该研究利用 Osterix(OSX/SP7)启动子驱动的Cre重组酶建立了在表达Osx的牙源性间充质细胞中特异性敲除Stat3的小鼠模型，将Stat3 CKO小鼠与其Cre阴性的同窝同性别对照小鼠进行比较，以探讨Stat3信号在出生后牙齿硬组织发育中的作用。

该研究中使用的Osx-Cre小鼠在Osx启动子的控制下表达GFP/Cre融合蛋白。在该系统中，表达Osx的细胞呈绿色荧光，通过GFP信号检测，确认在牙齿中Osx-Cre重组酶在表达在间充质细胞中，而在上皮细胞中不表达。对3周龄（3 weeks-old, 3WK）和8周龄（3 weeks-old, 8WK）小鼠的切牙进行大体观察，结果显示对照组小鼠切牙釉质表面光滑呈淡黄色，而Stat3 CKO小鼠切牙釉质表面粗糙伴不透明的白垩色（图1A）。对8WK小鼠切牙釉质进行Micro-CT扫描与三维重建，发现Stat3 CKO小鼠切牙釉质表面有明显缺损（图1B，黄色箭头所示）。然而，磨牙上没有观察到类似的釉质缺陷。

为了确定Stat3缺失引起的釉质矿化缺陷，对下颌门牙进行了扫描电镜和能谱仪分析。对照组小鼠切牙牙釉质表面平整光滑，无牙釉质缺损，或仅在高倍镜下可见少量细小裂纹和颗粒沉积（图1C）。相反，Stat3 CKO小鼠釉质表面粗糙，高倍镜下呈蜂窝状微孔（图1C）。能谱仪分析显示，Stat3 CKO小鼠切牙釉质中Ca含量（图1D）和Ca/P比值下降（图1F），说明这些裂缝和微孔可能是内外物质的交换通道，使Stat3 CKO小鼠釉质更容易脱矿。

为了追踪对照组小鼠和Stat3 CKO小鼠之间切牙釉质的组织学变化，进行了H&E染色。结果显示，Stat3 CKO小鼠的切牙唇侧颈环（labial cervical loop, laCL）发育异常，显著缩短。在出生后第5天(postnatal day 5, PN5)，Stat3 CKO小鼠的laCL与第一磨牙的远中面齐平，而对照组小鼠的laCL则位于第二磨牙的远中（图1G，laCL的位置由红色虚线表示）。在PN7小鼠中也发现了同样的观察结果。在Stat3 CKO小鼠中，laCL向后生长始终滞后于对照组（图1G）。此外，在高倍镜下，在PN7时，Stat3 CKO小鼠切牙中发现成釉细胞排列紊乱与牙本质之间出现了异位细胞核（图1G，红色箭头所示）。

图1 Stat3 CKO小鼠切牙釉质矿化缺陷

为研究Stat3对牙本质的影响，对3WK和8WK小鼠下颌骨进行Micro-CT扫描，观察磨牙和切牙的牙本质。结果表明，与对照组相比，Stat3 CKO组小鼠牙本质较薄，髓腔较大(图2A, B)。在3WK和8WK时，CKO小鼠牙根短于对照组小鼠(图2A、C)。此外, Stat3 CKO小鼠在8WK时，还观察到在第二磨牙对应的切牙髓腔内出现异常高密度影(图2A，用*表示)。H&E染色显示Stat3 CKO小鼠牙本质厚度减少(图2D)。对于PN7和8WK的下颌切牙，在Stat3 CKO小鼠的冠牙本质和根牙本质处观察到了骨样牙本质(图1G，蓝色箭头；图2E，黑色箭头)。

COL1A1是由成牙本质细胞分泌的一种矿化组织基质蛋白。与对照小鼠相比，在Stat3 CKO小鼠中，3周龄小鼠成牙本质细胞中COL1A1的表达水平显著降低(图2F，G)。此外，还观察到对照组小鼠牙本质小管从牙本质细胞到釉质呈放射状排列，而Stat3 CKO小鼠的牙本质小管不呈放射状排列，结构紊乱(图2F)。

图2 Stat3 CKO小鼠牙本质形成缺陷和牙根缩短

为了探讨Stat3对牙根发育的影响，该研究对第一磨牙牙根早期发育的组织学差异进行观察。在PN5时，对照组小鼠的Hertwig‘s上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath, HERS）向下延伸以启动牙根形成。相反，在Stat3 CKO小鼠中没有观察到HERS的延伸（图3A，HERS由黑色箭头表示）。在HERS内侧可见排列整齐的成牙本质细胞和相邻的前成牙本质细胞。相比之下，Stat3 CKO小鼠的HERS结构短而厚，缺少分化的成牙本质细胞。

由于在PN7，Stat3 CKO小鼠和对照组小鼠的HRES的组织学已经表现出明显差异，通过Ki67免疫荧光染色分析磨牙和切牙根尖区细胞的增殖情况。结果显示，在Stat3 CKO小鼠的间充质细胞中，Ki67阳性细胞显著减少（图3B,C）

图3 在Stat3 CKO小鼠中HERS的发育被破坏

Wnt/β-catenin信号通路在牙形态发生的各个阶段发挥多种作用。通过分析成牙相关蛋白DMP-1、OCN和β-catenin的表达，探讨Stat3在牙本质形成中可能的机制（图4A）。结果显示，在Stat3 CKO小鼠中β-catenin在成牙本质细胞和HERS中有表达，但表达低于对照组小鼠（图4B），而DMP-1和OCN的表达在对照组和Stat3 CKO小鼠之间没有显著差异（图4C, D）。

图4 β-catenin、DMP-1和OCN在Stat 3CKO小鼠中的表达

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究利用Cre-loxP系统条件性敲除牙源性间充质细胞中Stat3基因，发现Stat3 CKO小鼠表现出显著异常的牙齿表型，其特征是磨牙牙根变短，牙本质变薄，切牙形成骨样牙本质，揭示了Stat3在牙本质形成中的重要作用。同时在Stat3 CKO小鼠中发现了异常的釉质矿化，表明Osterix⁺细胞中的Stat3在牙根发育过程中对牙上皮和牙间充质的相互作用具有重要作用，Stat3可能通过上皮-间充质相互作用来影响釉质的发育。此外，在Stat3 CKO的Hertwig‘s上皮根鞘和成牙本质细胞中，β-catenin蛋白信号转导减少，Stat3或许通过β-catenin转导调节牙齿发育，需后续进一步研究证明。该研究为Stat3基因突变导致间充质细胞介导的牙齿硬组织发育障碍及其机制提供了更深入的见解。