揭示可溶性Aβ42寡聚体对神经元囊泡谷氨酸储存和释放的影响机制

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，研究表明其发生发展与致病性淀粉样蛋白-β（Aβ）在大脑中积累以及突触功能障碍和神经元大量死亡密切相关[1-3]。大量证据表明无论是在AD动物模型还是患者中Aβ都造成了兴奋性突触的损伤，并且可明显观察到谷氨酸（Glutamate，Glu）稳态受损[4-10]。在中枢神经系统中，谷氨酸是一种主要的兴奋性神经递质，其在囊泡内含量、胞吐释放量以及相应的释放比例对于突触可塑性以及学习、记忆机制的形成至关重要[11]，但在单细胞及单囊泡水平，Aβ₄₂寡聚体影响谷氨酸含量及其胞吐的过程与机制尚不明确。

该成果利用团队前期发展的谷氨酸纳米电化学传感器（Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 15803-15808），定量监测了可溶性Aβ₄₂寡聚体对神经元囊泡内谷氨酸储存和释放的影响过程，进一步结合分子生物学表征及动物模型验证，初步揭示了AD不同阶段Aβ₄₂寡聚体导致细胞胞吐紊乱机制。

为在单细胞水平探究Aβ₄₂寡聚体对神经元谷氨酸胞吐的影响，作者首先采用Aβ₄₂寡聚体孵育原代海马神经元，构建了AD不同时期对应的细胞模型。利用制备的谷氨酸纳米线传感器定量监测了AD细胞模型不同时期神经元曲张体囊泡内谷氨酸胞吐释放量，有趣的是，作者发现随着Aβ₄₂寡聚体孵育时间的增加，海马神经元曲张体囊泡胞吐释放谷氨酸分子量存在“先增加后下降”的现象。以上结果表明，在AD发生发展过程中，Aβ₄₂寡聚体影响海马神经元囊泡谷氨酸的胞吐过程（图1）

图1. Aβ₄₂寡聚体影响海马神经元囊泡谷氨酸的胞吐过程

为在单囊泡水平探究Aβ₄₂寡聚体影响谷氨酸胞吐释放紊乱的原因，作者将谷氨酸纳米线电极插入AD不同时期对应细胞模型的曲张体内，基于胞内囊泡碰撞电化学计数法（IVIEC），获取单个囊泡内谷氨酸的分子数。实验结果表明，随着孵育时间的增加，囊泡内谷氨酸的分子数量与胞吐释放的变化趋势一致，即在AD细胞模型早期（Aβ₄₂寡聚体孵育细胞30 min）持续增加，在AD细胞模型晚期（Aβ₄₂寡聚体孵育细胞300 min）持续降低。通过比较胞吐释放的谷氨酸分子数量和囊泡内谷氨酸分子数量，统计数据表明，随着孵育时间的增加，神经元囊泡内谷氨酸胞吐释放比例一直增加。进一步通过对胞吐释放参数进行分析，作者认为在疾病进程中Aβ₄₂寡聚体使胞吐释放融合孔增大，导致释放比例的持续增加（图2）。

图2. Aβ₄₂寡聚体影响囊泡内谷氨酸含量

为进一步探究囊泡内谷氨酸含量增加的原因，作者通过免疫荧光和免疫印迹方法分别在AD细胞和动物模型（APP/PS1）水平分析了I型囊泡谷氨酸转运蛋白（VGLUT1）在囊泡膜表面的表达。VGLUT1主要负责将谷氨酸装载到囊泡内，其在囊泡膜表面的表达量和功能活性影响囊泡对谷氨酸的装载速度和装载量[12-14]。结果显示无论是在AD细胞模型还是APP/PS1动物模型中，AD早期VGLUT1蛋白的表达量上升，而晚期VGLUT1的表达量下降。以上结果表明，Aβ₄₂寡聚体可能通过改变VGLUT1的表达，影响囊泡内谷氨酸的装载量，进而影响囊泡释放谷氨酸数量（图3）。

图3. Aβ₄₂寡聚体影响VGLUT1的表达

接下来，为了探究在疾病发生发展过程中囊泡谷氨酸分子的消耗路径，作者定量监测了Aβ₄₂寡聚体孵育30 min之后细胞的自发释放活动。除活动依赖的神经递质释放，中枢突触也有自发的突触电位产生，神经元可以自发发生活动不依赖的神经递质释放，但其概率较低。然而，作者研究结果发现AD细胞模型早期神经元自发释放的频率和谷氨酸分子数量明显增加（图4）。这些结果表明，Aβ₄₂寡聚体有可能改变了谷氨酸的胞吐方式。

图4. Aβ₄₂寡聚体引起早期AD细胞模型自发释放增加

作者为进一步探究导致神经元自发释放频率增加的原因，通过免疫荧光和免疫印迹方法分析了Vti1a在早期AD细胞和动物模型的表达量。Vti1a是Ramirez等于2021年鉴定的一个非经典的内小体SNARE蛋白，可调节小泡自发性融合。在静息状态时，Vti1a蛋白的高表达会引起囊泡膜和质膜融合，发生自发释放[15-17]。实验结果显示Aβ₄₂处理后Vti1a表达量明显增加，这表明Aβ₄₂寡聚体有可能介导了Vti1a蛋白的表达，促进囊泡自发与突触前膜融合，增加谷氨酸胞吐频率，同时通过增加融合孔的打开时间，导致自发释放谷氨酸含量增加（图5）。

图5. Aβ₄₂寡聚体引起神经元自发释放紊乱

文章结论与讨论，启发与展望

综上，本研究发现：1）在AD早期，Aβ₄₂寡聚体通过上调I型囊泡谷氨酸转运蛋白（VGLUT1）的表达，促进囊泡对谷氨酸的装载，进而增加囊泡谷氨酸含量及其释放量，引起神经元兴奋性损伤；2）随着疾病进程，Aβ₄₂寡聚体通过上调自发释放相关蛋白Vti1a的表达，提高神经元囊泡谷氨酸自发释放频率，伴随着VGLUT1蛋白表达的下调，最终导致AD晚期囊泡内谷氨酸含量及其释放量显著降低，神经元功能丧失（图5G）。这些结果为深入理解AD的发生、发展机制以及探索AD预防及治疗方案提供了重要参考。然而，本工作还有不足之处：在研究对象上，本文的电化学检测集中在培养的神经元，这不足以模拟神经系统内分子和细胞类型相互作用的复杂性，未来应在脑片乃至活体水平实时探测谷氨酸动态变化过程；在机制探究方面，Aβ₄₂寡聚体通过何种方式和途径介导VGLUT1蛋白以及Vti1a蛋白的表达尚不明确，还有待深入研究。