B细胞是免疫系统的重要组成部分，在保护身体免受各种病原体感染方面发挥着至关重要的作用。这些细胞能够通过其B细胞受体（BCRs）识别抗原，并通过体细胞基因重组和超突变（SHM）过程，进化产生对抗原有极高亲和力的抗体。BCR数据分析在传染病、过敏、自身免疫性疾病、肿瘤免疫和免疫肿瘤学的研究中被广泛采用。研究人员可以进一步鉴定抗原特异性单克隆抗体（mAb），开发治疗各种疾病的抗体。尽管在BCR分析领域，研究人员已建立了数据预处理，B细胞群体结构、量化特征的多种方法流程，但一种关键的方法，即多序列比对（MSA），仍然不能处理大批量的BCR数据，严重制约了克隆分组、B细胞谱系树构建、SHMs分析、抗体工程改造、结构建模等方面的深入应用，这对计算分析和数据处理方法带来了新挑战。

报告了一种名为Abalign的高速多序列比对算法，可用于抗体和BCR可变区序列的分析。Abalign算法能够突破经典方法在处理规模上的限制，使得以前几乎无法实施的GB级序列数据的多序列比对能够在普通个人电脑上短时间内完成。Abalign还开发成一款跨平台图形化软件，支持Windows、Linux和Mac系统。它不仅具备独特的多序列比对功能，还可以基于多序列比对的结果进行全面的BCR数据分析，无须任何编程即可完成VJ基因识别、克隆群聚类、B细胞系谱树、突变分析、多样性统计、Repertoire比较、人源化评估等诸多分析任务。

图1 论文封面

Abalign多序列比对算法采用了一种不同于传统先导树模式的方法，它基于该实验室之前开发的抗体编号AbRSA[1]方法实现高速比对。其基本思想（如图2所示）是：首先，使用动态规划算法将待比对序列与预设计的抗体/BCR共识序列进行对齐，以识别抗体/BCR的可变区域；其次，将对齐结果用标准化索引号标记，并存储在矩阵中，其中每一行存储一个序列，每一列包含大致对齐的残基；然后，进行扩展矩阵计算，因为一个编号位置可能包含多个残基，需要在同一列的残基较少的位置插入间隙，Abalign考虑了框架区（FR）和互补决定簇（CDR）的不同保守程度，并采用了不同的处理策略；最后，对扩展矩阵进行校正和优化，输出多序列比对结果。Abalign对抗体和BCR的多序列比对准确性达到并超过广泛使用的ClustalO、MUSCLE、MAFFT等方法，运行速度有数量级的提升，内存开销也显著小于常用软件，尤其在处理大规模数据时，Abalign的优势更加显著（如图3所示）。

图2 Abalign多序列比对算法流程

图3 Abalign多序列比对的耗时和内存测试结果

图4 Abalign软件的功能示意图

Clonal grouping：Abalign提供可调节的克隆群组定义方案，通过基于VJ基因的类型、CDR3长度和序列相似度等指标，将具有相似特征的BCR序列归类为一组，帮助用户深入了解BCR repertoire的组成和变化(图4A)。

B-cell lineage tree：Abalign能构建和可视化B细胞系谱树，展示了不同克隆之间的关系和发育路径。通过细胞系谱树，研究人员能够探索BCR的演化过程，了解突变、亲和力成熟以及选择压力等重要信息（图4B）。

Mutation profiling：Abalign通过色图形式展示突变频率的增加或减少，帮助用户分析突变对BCR亲和力成熟的贡献。这种可视化的突变分析有助于深入理解BCR的突变模式和选择过程（图4C）。

Diversity statistics：Abalign提供常用的克隆型多样性统计指标，如Shannon指数和Simpson指数等，帮助用户评估BCR库的多样性。这些统计指标反映了BCR序列的丰富度和均匀性，对于研究免疫应答的多样性变化具有重要意义（图4D）。

Repertoire comparison：Abalign能够定量化分析多个样本中克隆型的重叠，从而追踪克隆型的纵向变化，筛选出扩增的克隆型，并从多个个体中找出共同集合。该功能有助于研究疾病发展过程中抗体的成熟和进化，以及筛选单克隆抗体和疾病标志物（图4E/G/H/I/J）。

Humanness assessment：Abalign收集了超过一千万条的人类BCR/抗体序列，分析了每个位置的氨基酸类型频率。通过比较查询序列与氨基酸类型频率的关系，Abalign能够评估查询抗体的人源性，从而协助抗体的人源化改造（图4K）。