在进行基因表达量分析或是构建cDNA文库时，需要从组织或者细胞中提取RNA，获得纯度高、完整性好的RNA，对后续的实验至关重要。不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白质、DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程，Trizol法是最为常见也是最经典的提取方法。

基本原理

Trizol法：即异硫氰酸胍-苯酚法。

强变性剂异硫氰酸胍首先使细胞裂解，并使核蛋白复合体中的蛋白变性。

在特定pH条件下，由于DNA和RNA的溶解度不同而被分离，DNA位于中间相，RNA位于水相，再有机溶剂来沉淀RNA即可得到纯度较高的RNA。

RNA提取步骤

准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)1.匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10℅。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Trizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5.每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项

1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml Trizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃较长时间保存。3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。4.预期产量：1mg组织或1×10^6细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg。

常见问题

1.得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底B．RNA沉淀未完全溶解A260/A280<1 .65：a.检测吸光度时，rna样品没有溶于水，而溶于了te中。低离子浓度和低ph值条件下a280值偏高B．样品匀浆时加的试剂量太少C．匀浆样品时未在室温放置5分钟D．吸取水相时混入了有机相E．RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃C.细胞在用胰酶处理时过度D.溶液或离心管未经RNase去除处理E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染: A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液2.蛋白聚糖和多糖污染沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml Trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。3.RNase的污染内源性RNase是造成RNA降解最主要的原因。收集样本时，内源性RNA酶的释放会降解RNA，其降解速度与内源性RNase的含量以及环境的温度有关。在提取RNA时，用适当的匀浆方法和裂解液，并控制好起始量有助于避免内源性RNase导致的RNA降解。外源性RNase也是导致RNA降解的重要原因。实验时需要戴帽子、口罩以及无菌手套。操作要在清洁少灰尘的实验台完成。尤其要注意枪头及EP管。实验操作时，可将枪头和EP管浸泡在DEPC溶液中，进行高压灭菌后备用。必要时，也可在实验中使用商品化RNase inhibitor。