该研究提供了一种更高效且更长作用时间的抗肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的ASO纳米制剂，同时揭示了中性胞苷/阳离子混合脂质递送结构优化的ASO的功能和机制，具有良好的临床应用潜力。

CT102是一种靶向人胰岛素样生长因子1型受体(IGF1R)基因的磷酸化脱氧寡核苷酸，能有效抑制HCC细胞的增殖。为进一步提高CT102的抗肿瘤效果，本研究进一步使用了gamper修饰策略。CCK8结果(图1A)显示，通过增加糖环2'-位修饰位点，抗肿瘤活性增强。其中CT102MOE5对靶mRNA的基因沉默水平显著高于CT102，达到约80%的基因沉默(100 nM，图1B)。凋亡实验显示(图1C-D)，CT102MOE5显著增强了CT102诱导晚期凋亡的能力，是CT102的近两倍(57% vs 31%)。因此，确定CT102MOE5为最优gapmer候选物，并进行后续的末端分子缀合。末端缀合选取了不同的糖基分子，包括乙酰氨基半乳糖(G3/Gal)、乙酰氨基葡萄糖(Glu)和甘露糖(Man)等多种衍生结构。通过进一步的体外细胞评价发现，糖基缀合结构可以一定程度上提高药物的细胞摄取，这可能是细胞表面糖基化受体导致的。此外，肿瘤表现出增强的糖摄取特性，以维持其细胞的快速增殖，这有利于增加肿瘤细胞对药物的特异性内吞作用[12]。因此，部分缀合结构在抗增殖能力及靶基因沉默方面有进一步的提升。值得一提的是，本研究发现虽然缀合结构可以在一定程度上促进细胞摄取，但其基团大小会影响ASO进入细胞核的能力。ASO在细胞核中的分布的减少可能会降低其整体活性的发挥。Ionis制药公司同样也报导了与本研究类似的G3缀合结构GalNAc3-ASO用于HCC的治疗。然而，随后的体内验证表明，缀合物与非缀合物相比没有显着差异，而本研究发现的ASO在胞内定位的变化可能是造成活性无法进一步提升的一个重要原因[13]。

小鼠体内肿瘤生长28天结果(图2A-B)显示，与索拉非尼和CT102相比，CT102MOE5和其它几种缀合物的抗肿瘤效果有显著差异，并且缀合物组(G3/Gal/Glu/Man-CT102MOE5)优于CT102MOE5组，第28天的平均肿瘤大小分别是第0天的15.0、9.4、7.5和18.2倍(CT102MOE5-24.6倍)。在所有给药组中，Glu-CT102MOE5的抑瘤作用最强，停药后1周内肿瘤生长倍数变化最小，仅为1.1倍。随后，进行肿瘤内靶基因敲除的定量评估和IGF1R蛋白的免疫荧光分析。结果显示，靶标IGF1R mRNA的沉默(图2C)与蛋白表达的变化一致(图2D-E)。gapmer CT102MOE5进一步增强了CT102的体内活性，有效地沉默了IGF1R mRNA的表达水平(P<0.001)，并降低了随后的蛋白表达(P<0.01)。与CT102MOE5相比，G3-CT102MOE5在基因和蛋白水平上没有优势。但与CT102MOE5和G3-CT102MOE5相比，Glu-CT102MOE5进一步增强了基因沉默，抑制了蛋白表达水平(P<0.05)。总体而言，活性数据结果显示，Glu-CT102MOE5显著抑制肿瘤生长，被确定为抗HCC的最佳活性结构。

CT102及其衍生物引起生物学变化的作用机制被进一步研究。Western blotting检测IGF1R、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达水平。CT102、CT102MOE5和Glu-CT102MOE5给药24h后，IGF1R蛋白水平明显降低，而gapmer CT102MOE5和缀合物Glu-CT102MOE5均能有效抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，其中Glu-CT102MOE5的抑制能力最为显著(图3A)。PI3K-AKT信号通路在许多癌症类型中异常激活，在肿瘤细胞增殖和存活中起核心作用，并且是调节细胞增殖、分化和凋亡所必需的。CT102及其衍生物(尤其是Glu-CT102MOE5)可不同程度地有效降低靶蛋白IGF1R的合成，从而抑制下游PI3K-AKT信号通路，进而抑制肿瘤发展。此外，本研究还比较了靶向IGF1R mRNA的ASO (CT102、N-04、N-06)和siRNA (siIGF1R-1、siIGF1R-2)的细胞增殖抑制和基因沉默活性(图3D)。其中，ASO N-04的靶mRNA位点与CT102的靶mRNA位点相距52个碱基，靠近外显子1的末端。ASO N-06靶向IGF1R mRNA的外显子2，该外显子与siIGF1R-1靶向位点部分重叠。siIGF1R-2的靶向位点与CT102相同。在相同浓度(50 nM)下，ASO和siRNA在HepG2细胞中的IGF1R mRNA沉默活性具有可比性(图3B)，无显著性差异(~60%)。细胞增殖抑制活性结果显示(图3C)，CT102 (70.9%)对HepG2细胞增殖的抑制活性明显强于N-04 (48.5%)、N-06 (42.5%)、siIGF1R-1 (21.3%)和siIGF1R-2 (22.6%)。这些结果表明CT102具有复杂的抗肿瘤活性，提示CT102不仅抑制IGF1R的表达，还可能作用于其它凋亡相关基因。

因此，通过体外转录组学和蛋白质组学分析来评估CT102的可能靶标。结果显示，上千个基因和蛋白质发生改变，许多信号通路被影响(图4B)。与空脂材(Mix)相比，CT102同时有13个基因和蛋白上调，5个基因和蛋白下调(图4A)，差异表达基因富集多种肿瘤相关信号通路。除了已知的酪氨酸激酶受体介导的IGF1R信号转导发生变化外，PPAR、P53、DNA复制、错配修复等信号通路也存在显著差异(图4C-E)。此外，通过合理的化学修饰，gamper CT102MOE5和缀合物Glu-CT102MOE5影响的基因和蛋白数量减少，一定程度上增强了CT102的“on-target”效应。蛋白质组学结果显示，CT102、CT102MOE5和Glu-CT102MOE5组中约25%的差异表达蛋白定位于细胞核内，包括参与转录、磷酸化、磷酸酶激活和DNA/RNA结合蛋白的功能蛋白。结果发现，修饰后的CT102可以降低细胞核和细胞质中IGF1R mRNA的表达水平(图4F)，并对在肿瘤发生发展中具有功能作用的GAS2、POLA2、LGALS2和IGFBP1的表达产生显著影响。因此，针对如此高比例的CT102在细胞核中的潜在机制，尤其是具体作用值得探讨。结合转录组学和蛋白质组学分析结果，CT102及其衍生物不仅在酪氨酸激酶激活的PI3K-AKT通路中发挥作用，而且在DNA复制、抗炎、免疫微环境等许多影响肿瘤生长的过程中发挥作用。它们可以通过不完全匹配与其他mRNA (如GAS2、POLA2和LGALS2)相互作用，从而下调相关蛋白的表达，共同诱导肿瘤细胞的凋亡过程。表明ASO不仅可以靶向成熟mRNA阻碍翻译并发挥沉默活性，在细胞核中的作用有多种可能，如与pre-mRNA结合、启动裂解机制、阻断pre-mRNA加工形成成熟mRNA等。也可能与细胞核内互补的双链DNA结合形成三链体[14]，抑制DNA转录，或通过核酸适配体机制与转录因子或转录复合物结合，有效影响其转录[15-17]，间接导致相关基因或蛋白上调，如IGFBP1。