红细胞是血液中含量最丰富的一类细胞，它为人体所有器官及组织提供氧气。红细胞生成是从造血干细胞逐步分化形成成熟红细胞的过程。造血干细胞可先形成第一个红系祖细胞爆裂形成单位红系（BFU-E）[1]，然后BFU-E细胞分化为红系晚期祖集落形成单位红系（CFU-E）细胞和原红细胞。原红细胞进入末端红系分化形成嗜碱性红细胞、多色红细胞、正色红细胞，最终吐核形成成熟的红细胞[2]。红系祖细胞是有一定的增殖能力的多能性细胞，它的增殖受多种受体及细胞通路的调控，其中，c-Kit和EPOR是红系祖细胞表面两个最重要的受体。c-Kit是一种III型酪氨酸激酶，它的表达与激活是红系祖细胞增殖的关键。c-Kit在与其特异性配体SCF结合后，会形成二聚体并发生自磷酸化，进而激活细胞内的一系列通路，从而促进增殖[3]。EPOR是促红细胞生成素EPO的受体，主要在红系分化过程中起调控作用[4]。低浓度的EPO也可以促进早期红系祖细胞的增殖。发现了N6-甲基-2’-脱氧腺苷（6mdA）可以显著促进红系祖细胞的增殖。

该研究采用10种常见的核苷和脱氧核苷分别处理红系祖细胞，发现仅当6mdA处理时可以显著促进红系祖细胞的增殖（图1J）。并发现只有当第0天时加入6mdA进行培养才可以促进红系祖细胞的增殖（图1L-M），提示6mdA可能在早期红细胞生成过程中发挥作用。

进一步利用流式分选得到更纯净的早期红系祖细胞BFU-E及晚期红系祖细胞CFU-E（图2A），发现6mdA可促进早期红系祖细胞BFU-E的增殖，能将其增殖提高约10倍左右，而对CFU-E的增殖没有显著影响（图2B-C）。EdU掺入实验证明6mdA处理显著增加了BFU-E细胞增殖（图2D）。数据统计结果显示6mdA可维持BFU-E细胞增殖能力。在8天扩增培养后，6mdA核苷处理使超过60%的BFU-E细胞处于高增殖的状态，而未处理组仅30%（图2E）。直接收集扩增8天后BFU-E细胞图像显示，在初始培养细胞相同的情况下，6mdA核苷处理显著增加红系细胞的产量。与MTS检测结果一致，在扩增8天后，6mdA核苷处理将红系细胞最终的产量提高约10倍，且在与EPO和SCF共同培养条件下，6mdA处理组BFU-E细胞增殖倍数能超过5000倍，而仅有EPO和SCF培养下细胞增殖倍数为560倍（图2F）。除此之外，6mdA显著抑制红系祖细胞的凋亡（图2G-H）。

对6mdA培养的BFU-E细胞进行转录组测序发现，6mdA引起BFU-E细胞内多个基因转录水平发生变化。在这些变化的基因中，红细胞生成所必需的受体酪氨酸激酶c-Kit的表达上调。除此之外，促进包括红系祖细胞在内的造血祖细胞增殖的重要转录因子Myb和Gata2的表达也显著上调。相反，在红系分化后期表达的几个重要基因的转录水平显著被抑制，包括两个在血红素合成中起关键作用的两个酶Alas2（5-aminolevulinate synthase 2）和Fech（ferrochelatase），促进核凝结的重要蛋白Wdr26（WD40 repeat protein 26），红细胞离子交换器Slc4a1（solute carrier family 4 member 1）以及血型糖蛋白Gypa（glycophorin A）。建立红系终末分化正确起始和进展的重要转录因子Gata1、Klf1和Spi1的表达也显著下调（图3A）。三个红系祖细胞相关的转录因子（c-Kit，Myb，Gata2）和八个在红系分化末期表达的基因（Alas2、Fech、Wdr26、Slc4a1、Gypa、Gata1、Klf1、Spi1）的表达通过q-PCR得到进一步的验证（图3B-C）。

由于酪氨酸激酶受体c-Kit的转录水平和它表达的动态变化都维持在较高的水平，而且它是支持红系祖细胞增殖的关键蛋白。因此，c-Kit的蛋白表达与磷酸化也被验证。与mRNA水平变化相一致，6mdA显著增加了c-Kit的蛋白表达，在100 μM 6mdA处理后，c-Kit的蛋白表达在扩增6天后提高4倍左右。除此之外，c-Kit上与MAPK和PI3K/AKT信号通路相关的两个磷酸化位点Tyr568/570以及Tyr719的磷酸化均增加2倍左右（图3D-E）。利用慢病毒shRNA的方法对BFU-E细胞中c-Kit进行敲低，当c-Kit敲低40%左右时，BFU-E细胞的增殖被明显的抑制，而6mdA对BFU-E细胞增殖的促进作用也受到一定影响（图3F-G）。

为了探究6mdA刺激的c-Kit激活能否导致下游PI3K/AKT及MAPK/ERK信号通路的激活，这些通路中重要的下游蛋白ERK1/2及AKT的磷酸化也被检测。结果显示，6mdA处理对ERK1/2本身的表达没有明显的作用，而ERK1/2的磷酸化在不同扩增天数都有明显的增加。定量结果显示在扩增2天，6天后，分别增加了3.0倍和4.3倍，表明MAPK/ERK通路被激活（图3H-I）。同样的，AKT的表达在6mdA处理后也没有明显的变化，但AKT的磷酸化在6mdA处理后显著增加，在扩增2天，4天，6天后分别增加了2.0，3.7和2.6倍（图3J-K）。总的来说，这些结果证明6mdA处理引起c-Kit及下游ERK/MAPK，PI3K/AKT通路的激活，这可能是造成红系祖细胞增殖提高的原因（图4）。

图3. 6mdA促进c-Kit及其下游通路的激活

图4. 文章总结图