开发微流控平台Drop-BS实现高通量单细胞甲基化组测序

DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，在调节基因组表达中发挥着关键作用。单细胞基因组亚硫酸氢盐测序 (single-cell bisulfite sequencing: scBS-seq) 可在基因组范围内以单核苷酸的分辨率“绘制”单细胞甲基化组。现有的scBS-seq制备文库都是在单个试剂管或孔板中完成。尽管这些技术可以通过并行或长时间运行来处理相对大量（比如数千个）细胞，但这些平台本质上不适合高通量制备单细胞测序文库。相比之下，液滴微流控技术可以快速生产和操作数百万个油包水液滴，其可作为微反应器，用于分离和处理单细胞，并已成功用于高通量地制备各种单细胞omics以及 multi-omics 测序库。但截至目前，学界和业界还没有基于微流控液滴的高通量地制备scBS-seq测序文库的平台。

该论文作者开发了第一个基于液滴技术的高通量scBS-seq平台“Drop-BS”，实现了在 2 天内可以快速生成10,000 个单细胞的 BS-seq文库。文章的第一作者张强是弗吉尼亚理工大学的博士生。作者首先使用混合细胞系对平台进行可质量验证，还使用该平台分析了复杂的小鼠和人脑样本中多个细胞类型的甲基化组。

图1 微流控技术平台

Drop-BS 涉及 5 个主要步骤和 3 个微流控芯片：1）单细胞DNA液滴生产和DNA片段化（图1a 和c）：使用液滴生成微流控芯片将单个细胞/细胞核和含有MNase的裂解液包裹在单个液滴中，用于细胞裂解和基因组DNA 碎片化。2）单细胞DNA和单个条形码珠液滴配对和融合（图1b和d-f）：液滴融合芯片的上游用于产生含有单个条形码珠和连接酶试剂的液滴，该液滴与下游重新注射入芯片的单细胞DNA 液滴在由高压高频交流电产生的介电电泳下发生融合。3）连接单细胞DNA和条形码：将融合的液滴收集到管中并暴露于紫外线下，带条形码的寡核苷酸序列从条形码珠表面释放出来，并在连接酶的催化下附加到片段化的 DNA 上，完成单细胞DNA标记，此时将液滴破碎并纯化DNA。4）基于液滴的DNA亚硫酸氢盐转化：作者发现，与在管中反应相比，在液滴中进行DNA亚硫酸氢盐转化可显着提高 DNA 回收率，因此作者使用亚硫酸氢盐液滴芯片生成包含带标记DNA 和亚硫酸氢盐的液滴，加热液滴进行DNA亚硫酸氢盐转化，可实现 99.0% 的转化率。5）随机扩增和PCR：经亚硫酸盐处理过的DNA进行随机扩增和后续PCR，以生成可以测序的文库。

图2 人类的大脑前额皮质 (PFC) 的甲基化测序数据

作者首先评估了 Drop-BS 生成的单细胞甲基组数据的纯度。即将 GM12878 人类细胞核和小鼠脑细胞核以 1:1 的比例混合，制备约 1000 个细胞的scBS-seq测序文库。测序数据表明，其中绝大多数 (~96%) 的单细胞测序reads只属于人类 hg19 基因组 (n=487) 或小鼠 mm10 基因组 (n= 319）。证明了 Drop-BS 平台有效限制了液滴反应器之间的串扰，产生了高纯度的单细胞数据集。作者还应用 Drop-BS 技术来研究复杂的小鼠和人类的大脑前额皮质 (PFC) 样本。两套独立人脑单细胞甲基化组数据的对比结果表明（图2a-f），Drop-BS具有较高的可重复性和准确性。通过使用单细胞mCH甲基化组得到的聚类结果，也可以通过传统的标记基因(marker genes)表达量所验证（图2g）。

文章结论与讨论，启发与展望

Drop-BS 是第一个高通量生成单细胞甲基化组数据的平台，可帮助研究者实现对大量单细胞甲基化组的研究，也有耦合其他技术以实现multi-omics-seq的潜力。相比于其他单细胞甲基化测序技术，Drop-BS在通量方面有很大的优势。未来对Drop-BS技术的优化可集中于：通过调整流速和优化芯片设计进一步提高单细胞处理通量和实现高度自动化；通过优化液滴中的生化反应（比如连接酶的反应）提高单细胞DNA标记效率和单细胞检测灵敏度。