发现病毒感染后调控肠道驻留型CD4+T细胞效应和记忆基因的关键转录程序

CD4⁺T细胞响应感染会分化成多种亚群包括T_H1（type 1 helper cells）、T_H2、T_H17、T_REG以及T_FH（follicular helper cells）[1]。病原体清除后，一部分细胞会持续存在于次级淋巴器官 (secondary lymphoid organs, SLOs) 或组织中成为长寿的组织驻留型记忆T细胞（tissue-resident memory T cells,T_RM）[2]，T_RM的表型、功能和迁移指令均具有异质性[3-5]。长寿的CD4⁺T_RM是免疫记忆的重要组成部分，但它们的发育来源和转录调控尚不清楚。

研究了急性 LCMV 感染后小肠 (small intestine，SI) 中CD4⁺T细胞的分化调控。作者发现位于固有层的CD4⁺T_RM细胞在表型、转录和表观遗传学上与T_H1细胞相似，并随着时间的推移获得了成熟的T_RM程序。CD4⁺T_RM同时表达Bcl6和Blimp1，它们与Id2一起组成建立T_RM所必需的转录因子。这些发现强调CD4⁺T_RM具有表达效应基因和记忆基因的混合转录程序，并表明在病毒感染中，循环T_H1细胞是SI CD4⁺T_RM的发育前体细胞。

为探究病毒感染后CD4⁺T_RM的发育来源尤其是次级淋巴器官SLOs中的T_RM与效应CD4⁺T_H细胞亚群的相关性，作者用急性LCMV感染模型研究了CD4⁺细胞的反应过程。将能够识别LCMV的特异性SMARTA CD4⁺T细胞（SMARTA T cell receptor transgenic CD4⁺T cells）过继回输到受体小鼠体内，随后感染LCMV-Arm。通过流式分析脾脏（spleen，SPL）、间质淋巴结（mesenteric lymph nodes，mLNs），小肠上皮内淋巴细胞（intra-epithelial lymphocytes，IEL）、小肠固有层淋巴细胞（LP lymphocytes，LPL）、肾脏（kidneys，KID）、肝脏（liver，LIV）以及肺脏组织中CD4⁺T细胞变化情况。发现在感染第21天和40天，SPL和mLN中SMARTA CD4⁺T细胞主要分化为T_H1（SLAM+）和T_FH（CXCR5⁺）细胞。在感染第7、21、40天，所有组织和SPL以及mLN中SMARTA CD4⁺T细胞主要为SLAM+CXCR5-T_H1细胞，说明T_RM与T_H1细胞亚群存在直接相关性。CD8⁺T_RM会表达CD69和CD103，作者进一步分析发现IEL和LPL中大部分CD4⁺T_RM表达CD69而不表达CD103，这区别于CD8⁺T_RM。终末分化的CD4⁺T会表达Ly6C，而多潜能性细胞为Ly6C^-。在感染第7天，SPL、mLN以及小肠中有50%的CD4⁺T细胞为Ly6C⁺。在感染第21天，小肠中大部分CD4⁺T_RM均为Ly6C^-，而循环中的CD4⁺T细胞仍然为Ly6C⁺。说明组织中的CD4⁺T细胞可以通过CD69⁺和Ly6C^-与循环细胞区分。与SMARTAT细胞一致，作者用LCMV-Arm-specific NIP小鼠来源的CD4⁺T细胞和GP-specific SAMRTA细胞进一步证明了小肠中CD4⁺T_RM的表型与T_H1细胞表型相近并表达CD69。

图1. CD4⁺T_RM在病毒感染后获得T_H1细胞特征

作者通过RNA-seq分析发现，感染第7天 IEL和LPL中CD4⁺T细胞与T_H1细胞聚类相近。基因富集分析发现感染第21天SI中CD4⁺T细胞明显在T_H1细胞基因表达特征富集，并且与T_H1和脾脏T_FH相比CD4⁺T_RM在CD8⁺T_RM及CD4⁺NLT细胞基因表达特征富集，说明CD4⁺T_RM在记忆早期阶段已经上调了组织驻留相关基因的表达。与naïve CD4⁺T细胞相比，IEL和LPL中效应记忆细胞明显表达小肠归巢趋化因子受体如Ccr9，同时表达与T_RM程序启动相关的基因如上调CD69，下调Klf2和S1pr1。感染第21天IEL和LPL中的CD4⁺ T_RM表达同时表达effector/T_H1和memory/T_FH程序相关基因。D21 SI和T_H1群体同时表达Bcl6和Prdm1，但是这些TF是已知的相互拮抗转录因子。ATAC-seq数据同样显示感染第7天IEL和T_H1相似而显著区别于naïve和T_FH细胞。这些结果说明LCMV-Arm感染后CD4⁺T_RM与效应T_H1细胞在转录组、染色质组相似，说明这两群细胞具有相关性。

图2. CD4⁺T_RM在病毒感染后在转录和表观遗传修饰与T_H1相似

作者进一步探究了循环CD4⁺T细胞和SI CD4⁺T_RM细胞在感染后的分化和功能。CCR9和CD49a能够介导细胞肠道归巢，分析发现在IEL和LPL中CCR9+CD49d+CD4⁺T比例增加，并且SPL中高于80%的CD4⁺T细胞、mLN中高于90%的CD4⁺T细胞为SLAM+T_H1细胞，说明循环的T_H1细胞与SI CD4⁺T_RM之间存在关联性。作者进一步评估了SI CD4⁺T_RM与脾脏效应T细胞亚群的功能差异，在体外用SMARTA CD4⁺T细胞特异性抗原肽GP61-80刺激后，发现感染早期效应阶段的CD4⁺T细胞无论在SI还是脾脏中均高表达IFN-γ和TNF-α，而在记忆阶段与脾脏T细胞相比，SI中仅有少量CD4⁺T细胞表达IFN-γ和TNF-α。与SPL和mLN中CD4⁺T细胞相比，SI CD4⁺T细胞在效应和记忆阶段均表达高水平granzyme A 和 B。这些结果进一步强调了SI CD4⁺T_RM与T_H1效应细胞之间的相似性。

RNA-seq结果显示感染第7天的CD4⁺T_RM细胞获得了记忆CD4⁺T_RM 13-15%的基因表达特征，而CD8⁺T_RM在感染第七天已经获得成熟T_RM约57%的基因表达特征，说明CD4⁺T_RM在感染后的成熟动力学过程与CD8⁺T_RM不同。这可能与细胞的组织定位有关，CD8⁺T_RM在感染D21天主要分布在IEL中，而CD4⁺T_RM主要在LP中。因此CD4⁺T_RM的成熟比CD8⁺T_RM需要更长的时间。为了探索效应和记忆 SI CD4⁺ T细胞亚群之间转录程序的差异，并评估这些群体中细胞的异质性，作者进行了bulk RNA-seq和scRNA-seq。结果显示感染D21天 SPL和LPL样本都具有独立的基因特征，感染D7天的细胞仅表达少量SPL或SI特征基因。T_H1记忆细胞特征基因主要在感染D7天和感染D21天SI细胞中表达，而记忆T_FH特征基因主要在感染D21天SPL中表达。RNA velocity分析显示感染早期的脾脏CD4⁺T细胞向IEL和LPL群体逐步发展成成熟T_RM群体的过程。综上感染早期SI中T细胞与脾脏T细胞相似，随后逐步分化成组织定居型CD4⁺T细胞。

图3. 效应CD4⁺T细胞逐步获得成熟SI T_RM程序

为确定CD4⁺T_RM是否存在异质性，作者通过scRNA-seq分析感染第21天 SPL和LP中CD4⁺T细胞，结果显示LPL簇在记忆性T_H1，NLT以及CD8⁺T_RM特征基因均有富集，而SPL仅在记忆T_FH特征基因存在富集。分析调控效应T细胞和记忆T细胞转录因子发现，SPL群体存在异质性，既表达效应程序基因也表达记忆程序基因，并且测序结果推测Blimp1、Id2以及Bcl6能够调节CD4⁺T_RM程序，使得CD4⁺T_RM能够长期维持效应和记忆功能。随后作者通过Blimp1-YFP SMARTA CD4⁺T、Blimp1-KO SMARTA CD4⁺T、Id2-YFP SAMRTA CD4⁺T过继回输等实验发现Blimp1和Id2缺失后影响了早期CD4⁺T_RM的分化，减少了SI CD4⁺T_RM的数量。基于T_H1和CD4⁺T_RM在表型、转录组、功能方面的相似性，作者推测效应T_H1群体中包含CD4⁺T_RM祖细胞，进一步通过过继回输T_H1细胞和T_FH细胞，证明了T_H1细胞会分化成SI T_RM，而T_FH主要在SPL和mLN中。

图4. SI CD4⁺T_RM具有异质性，同时表达效应和记忆进程相关基因

Bcl6在记忆阶段SI CD4⁺T_RM中表达，作者进一步探究了Bcl6是否调控CD4⁺T_RM，用Bcl6-KO SMARTA T细胞过继回输实验发现，感染D7天脾脏和淋巴结中CD4⁺T SMARTA细胞显著减少，并且在记忆阶段细胞减少更加明显。Bcl6的缺失没有影响感染早期CD4⁺T细胞在SI中的累积，但是在感染第14天和第21天，Bcl6-KO细胞较WT细胞的比例和数量显著减少。通过RNA-seq分析感染早期WT和Bcl6-KO SMARTA CD4⁺T细胞，发现脾脏中Bcl6-KO细胞与T_H1表型相似，SI中感染早期的Bcl6-KO细胞与感染21天WT CD4⁺T细胞相似。说明Bcl6的缺失促进了效应T细胞向成熟T_RM细胞分化的进程。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者探究了病毒感染后CD4⁺ T_RM的分化和转录编程。在急性LCMV病毒感染后，SI中的感染早期 CD4⁺ T_RM祖细胞群具有异质性，并且在表型、转录和表观遗传学上与脾脏T_H1细胞群相似。在免疫记忆阶段，CD4⁺T_RM同时表达T_H1/effector和T_FH/memory相关基因，包括在同一细胞中共表达拮抗因子 Blimp1和Bcl6。该研究确定了Blimp1和Id2在支持早期CD4⁺T_RM发展中的作用，而 Bcl6可以介导组织中具有T_H1特征的CD4⁺T_RM的成熟和/或维持。需要进一步的工作来阐明CD4⁺ T_RM如何在组织中维持，特别是Blimp1、Bcl6和Id2如何相互作用调节效应和记忆阶段的T_RM基因表达程序。