揭示了人源SPCA1蛋白转运钙离子的工作机制

钙离子（Ca²⁺）是细胞中最丰富的信号分子之一。Ca²⁺调节许多细胞功能，包括增殖、分化、凋亡、分泌、收缩和受精等。[1]高尔基体作为Ca²⁺储存的关键细胞器之一，参与调节Ca²⁺稳态和随后的细胞内C^a2+信号传导。[2]此外，高尔基体中合适的Ca²⁺浓度对正常的蛋白质合成、加工和分选至关重要。[3]分泌途径钙ATP酶（Secretory-pathway Ca²⁺-ATPases, SPCA1）主要定位于高尔基体膜上，对维持高尔基体的正确结构和功能起重要作用。[4]SPCA1属于P-type IIA ATPases家族，利用ATP水解释放的能量将Ca²⁺从细胞质基质泵入高尔基体腔，转运Ca²⁺过程遵循典型的Post-Albers循环。[5]研究表明，SPCA1功能失常可能会引发海利-海利病（Hailey-Hailey disease，HHD，家族性良性慢性天疱疮）[6]和乳腺癌[7]的发生。因此，深入研究人源SPCA1蛋白（hSPCA1）介导的Ca²⁺转运机理具有重要的生物医学意义。

为了详细了解人源SPCA1（hSPCA1）的转运机制，研究团队首先通过外源重组表达、分离纯化出高质量的人源SPCA1（hSPCA1）蛋白，并与不同的ATP或磷酸盐类似物孵育；进一步利用冷冻电镜单颗粒技术成功解析出hSPCA1转运Ca²⁺过程中CaE1、CaE1-ATP、CaE1P-ADP、CaE2P、early E2P以及 E2~P的六个中间态近原子分辨率结构为了详细了解人源SPCA1（hSPCA1）的转运机制，研究团队首先通过外源重组表达、分离纯化出高质量的人源SPCA1（hSPCA1）蛋白，并与不同的ATP或磷酸盐类似物孵育；进一步利用冷冻电镜单颗粒技术成功解析出hSPCA1转运Ca²⁺过程中CaE1, CaE1-ATP, CaE1P-ADP, CaE2P, early E2P, 以及 E2~P的六个中间态近原子分辨率结构（图1）。

图1 hSPCA1转运底物过程中六个中间态的原子模型

结合hSPCA1的原子模型和分子动力学模拟，研究团队确定了hSPCA1的Ca²⁺结合位点，该结合位点由跨膜螺旋4上的Val303, Ala304, Ile306和Glu308, 以及跨膜螺旋6上的Asn738和Asp742等六个氨基酸组成，对应于SERCA的Ca²⁺结合位点II。hSPCA1对应于SERCA（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase，SERCA）的Ca²⁺结合位点I的部分氨基酸被替代而破坏了位点I的Ca²⁺配位几何, 这也许可以解释为什么hSPCA1在每个循环中只转运一个Ca²⁺。

随后，研究团队分析了hSPCA1磷酸化过程CaE1→CaE1-ATP→CaE1P-ADP的构象变化，ATP类似物AMP-PCP的结合使hSPCA1的N结构域朝着P结构域旋转了~57°，其它区域几乎不动。CaE1P-ADP与CaE1-ATP的构象非常相似。通过hSPCA1、SERCA、以及钠钾ATP酶（Na⁺/K⁺-ATPases, NKA）等三种P-type II ATP酶的结构比较分析，研究人员发现，三种蛋白的胞质头部在结合底物的E1态都保持开放状态，SERCA和NKA的胞质头部分别在E1-ATP态和E1P-ADP态关闭，而hSPCA1的胞质头部在CaE1→CaE1-ATP→CaE1P-ADP状态转换过程始终保持开放，这或许是SPCAs区别于其他P-type II ATPases(如SERCAs和NKAs)的一个关键特征（图2）。

图2 hSPCA1的胞质头部在磷酸化过程中始终保持开放状态，而SERCA和NKA的胞质头部分别在CaE1-ATP态和NaE1P-ADP态关闭。

此外，该研究首次获得了CaE2P状态的结构，通过将该结构与CaE1P-ADP结构比对，研究人员发现从CaE1P-ADP→CaE2P，胞质区三个保守的结构域（A、P、N结构域）均显著重排，胞质头部关闭，ADP结合位点被A结构域占据，而跨膜区域只有少量重排，Ca²⁺结合位点保持完整，并且Ca²⁺被封闭在跨膜螺旋中（图3a-e）。

TGE 基序被认为与蛋白质去磷酸化密切相关，[9]并且在底物转运过程中会有明显的构象变化，[10，11]然而，这种运动与底物转运之间的联系还没有得到很好的阐明。CaE2P态hSPCA1结构分析显示：对去磷酸化过程非常重要的TGE 基序在Ca²⁺释放之前已经靠近磷酸化的天冬氨酸（图3c）; 结合SERCA的CaE1P态结构信息怕[12]，TGE 基序构象变化很可能发生在CaE1P→CaE2P转变过程中。更有趣的是，该研究通过电镜三维分类分析，获得了early E2P结构。通过对这两个结构的比对分析发现，从CaE2P→early E2P状态，胞质区只有A 结构域发生了~10.2°的旋转，而跨膜区整体出现了显著重排，跨膜螺旋4和6相互分离，破坏了Ca²⁺结合位点，并形成朝向高尔基体腔的开放口袋，Ca²⁺从该口袋进入到高尔基体腔中（图3f-i）。这些结果说明A 结构域的旋转构象变化可能在诱导Ca²⁺释放中起关键作用，对我们理解P-type II ATPases转运底物过程提供了关键结构信息。

图3 CaE2P与early E2P结构

将early E2P结构与最近报导的E2P结构[8]比对分析得出，从early E2P至E2P，胞质头部几乎不动，而跨膜区域显著重排，跨膜螺旋[6-10]向跨膜螺旋4靠近，关闭了Ca²⁺释放通道，在此过程中，跨膜螺旋6扭转，扭曲了Ca²⁺结合位点，阻止了Ca²⁺的重新捕获（图4a-c）。为了了解hSPCA1去磷酸化过程中的构象变化，研究人员将hSPCA1蛋白与AlF₄^-孵育，成功获得了E2~P结构。在去磷酸化过程中，胞质区的A 结构域和N 结构域分别旋转了~28.8° 和 ~17.0°，而跨膜螺旋几乎不动（图4d-g），说明去磷酸化过程胞质区域的运动对Ca²⁺释放途径门控的影响非常小。

图4 E2P与E2~P结构比对

最后，基于六个不同构象的hSPCA1高分辨率三维结构，研究人员应用分子动力学模拟明确了Ca²⁺进入和离开hSPCA1的完整途径，全面揭示了hSPCA1转运Ca²⁺的工作机制（图5）。

图5 hSPCA1转运Ca²⁺的工作模型

文章结论与讨论，启发与展望

综上，研究人员通过结构生物学、分子动力学模拟等技术手段，明确了hSPCA1的Ca²⁺结合位点和潜在的Ca²⁺进出通道，阐明了 hSPCA1区别于其他P-type ATPases的关键结构特征，揭示出Ca²⁺转运过程中的一系列构象变化，扩大了对P-type ATPases的理解，为开发针对hSPCA1的特异性激动剂和抑制剂提供了重要的结构信息，为治疗hSPCA1相关疾病提供理论基础和重要线索。然而，为了更加全面的理解hSPCA1转运Ca²⁺的动态过程，仍需要解析多个重要的中间结构，如E1，CaE1P和E2的结构，与hSPCA1特异性结合的小分子或许有助于这些结构的解析。